Эволюция энергетических процессов у эубактерий - (реферат)

В главах 11 и 12 были обсуждены проблемы возникновения первичной клетки из гипотетической протоклетки и последующего пути прогрессивной эволюции первичной клетки. Как было обнаружено в 70-х гг. , на раннем этапе этого пути могло произойти выделение трех основных ветвей, каждая из которых самостоятельно и независимо эволюционировала, результатом чего явилось существование в рамках прокариотной клеточной организации двух крупных таксономических групп: эубактерий и архебактерий. Подавляющее большинство известных прокариот относится к эубактериям. Именно у них достаточно хорошо изучены основные этапы прогрессивной эволюции, связанные с совершенствованием энергетических процессов. Архебактерии представляют собой к настоящему времени разрозненные группы со специфическими типами энергетического метаболизма. Имеющегося материала явно не достаточно для создания каких-либо эволюционных построений внутри группы архебактерий. ГЛАВА 13. БРОЖЕНИЕ. ТИПЫ ЖИЗНИ, ОСНОВАННЫЕ НА СУБСТРАТНОМ ФОСФОРИЛИРОВАНИИ Наиболее примитивным способом получения энергии, присущим определенным группам эубактерий, являются процессы брожения. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕСCOВ БРОЖЕНИЯ

"Брожение" — это сугубо микробиологический термин. Он характеризует энергетическую сторону способа существования нескольких групп эубактерий, при котором они осуществляют в анаэробных условиях окислительно-восстановительные превращения органических соединений, сопровождающиеся выходом энергии, которую эти организмы используют. Поскольку брожение протекает без участия молекулярного кислорода, все окислительно-восстановительные превращения субстрата происходят за счет его "внутренних" возможностей. Процесс брожения связан с такими перестройками органических молекул субстрата, в результате которых на окислительных этапах процесса высвобождается часть свободной энергии, заключенной в молекуле субстрата, и происходит ее запасание в молекулах АТФ. В процессе брожения, как правило, происходит расщепление углеродного скелета молекулы субстрата. Круг органических соединений, которые могут сбраживаться, довольно широк. Это углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты, пурины, пиримидины. Химическое вещество может быть подвергнуто сбраживанию, если оно содержит неполностью окисленные (или восстановленные) углеродные атомы. В этом случае есть возможность для окислительно-восстановительных преобразований между молекулами (или внутри одного вида молекул), возникающими из субстрата. В результате одна часть продуктов брожения будет более восстановленной, другая — более окисленной по сравнению с субстратом. Продуктами брожений являются различные органические кислоты (молочная, масляная, уксусная, муравьиная), спирты (этиловый, бутиловый, пропиловый), ацетон, а также CO2 и H2. Обычно в процессе брожения образуется несколько продуктов. В зависимости от того, какой основной продукт накапливается в среде, различают молочнокислое, спиртовое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожений. Следовательно, в каждом виде брожения можно выделить две стороны: окислительную и восстановительную. Процессы окисления сводятся к отрыву электронов от определенных метаболитов с помощью специфических ферментов (дегидрогеназ) и акцептированию их другими молекулами, образующимися из сбраживаемого субстрата, т. е. в процессе брожения происходит окисление анаэробного типа. Энергетическая сторона

Собственно энергетической стороной процессов брожения является их окислительная часть, поскольку реакции, ведущие к выделению энергии, — это реакции окисления. Существует несколько исключений из этого правила: некоторые анаэробы часть энергии при сбраживании субстрата получают также в результате его расщепления. Примитивность процессов брожения заключается в том, что из субстрата в результате его анаэробного преобразования извлекается лишь незначительная доля той химической энергии, которая в нем содержится. Продукты, образующиеся в процессе брожения, все еще содержат в себе значительное количество энергии, заключавшейся в исходном субстрате. Чтобы четче представить разницу в энергетическом выходе процессов брожения и дыхания, приведем данные по изменению уровней стандартной свободной энергии для процессов гомоферментативного молочнокислого брожения и дыхания при одинаковом исходном энергетическом субстрате (глюкоза):

DG0' = –196, 65 кДж/моль;
DG0' = –2870, 22 кДж/моль.

В процессе гомоферментативного молочнокислого брожения синтезируются 2 молекулы АТФ на 1 молекулу сброженной глюкозы; в процессе дыхания при полном окислении молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ. В обоих случаях эффективность запасания выделяющейся энергии в макроэргических связях АТФ приблизительно одинакова. При брожении некоторые реакции на пути анаэробного преобразования субстрата связаны с наиболее примитивным типом фосфорилирования — субстратным фосфорилированием. К синтезу АТФ по механизму субстратного фосфорилирования ведут катаболические реакции, которые в зависимости от своей химической природы могут быть разделены на два типа. Большинство относится к окислительно-восстановительным реакциям. Богатые энергией соединения возникают в процессе брожения на этапах анаэробного окисления. Например, окисление фосфоглицеринового альдегида (ФГА), катализируемое ФГА-дегидрогеназой, приводит к образованию богатого энергией метаболита — 1, 3-дифосфоглицериновой кислоты (1, 3-ФГК). Анаэробное окисление пировиноградной или a-кетоглутаровой кислот приводит к образованию высокоэнергети-ческих метаболитов — ацетил-КоА40 или сукцинил-КоА соответственно. 40 Символ "КоА" обозначает кофермент А, связанный с ацильной группой (R-CO~S-KoA), "КоА-SH", находящийся в свободном состоянии. Второй тип реакций связан с расщеплением субстратов или промежуточных продуктов, образующихся из них. Катализируются эти реакции ферментами, относящимися к классу лиаз. Например, у гетероферментативных молочнокислых бактерий высокоэнергетический ацетилфосфат образуется из ксилулозо-5-фосфата в реакции, катализируемой фосфокетолазой: ксилулозо-5-фосфат + ФН ® ФГА+ ацетилфосфат + H2O.

К реакциям подобного типа относится также расщепление цитруллина, приводящее к синтезу карбамоилфосфата — соединения с макроэргической фосфатной связью: цитруллин + ФН ® карбамоилфосфат + орнитин.

Богатые энергией соединения, образующиеся в реакциях рассмотренных выше типов, представляют в большинстве случаев ангидриды фосфорной кислоты или тиоэфиры органических кислот. Последние используются для синтеза АТФ через ферментативную стадию образования соответствующих ацилфосфатов: ацил-КоА + ФН ® ацилфосфат + КоА-SH.

Из других высокоэнергетических соединений важное место в энергетике процессов брожения принадлежит фосфоенолпировиноградной кислоте (ФЕП). Эти соединения характеризуются тем, что свободная энергия, освобождающаяся при их гидролизе, находится в области значений от -35 до -88 кДж/моль и с помощью соответствующих ферментов может быть перенесена на молекулы АДФ. Несмотря на большое число углеродных субстратов, доступных для сбраживания, количество реакций, приводящих непосредственно к синтезу АТФ при брожениях, сравнительно невелико. Наиболее распространены следующие из них: 1) ацетилфосфат + АДФ ® ацетат + АТФ;

2) 1, 3-фосфоглицериновая кислота + АДФ ® 3-фосфоглицеринновая кислота + АТФ; 3) фосфоенолпировиноградная кислота + АДФ ® пировиноградная кислота + АТФ. Другие реакции субстратного фосфорилирования ограничены какими-либо специфическими видами брожения. Например, сбраживание некоторых пиримидинов и аргинина, осуществляемое отдельными видами бактерий из рода Streptococcus, приводит к образованию карбамоилфосфата, фосфатная группа которого переносится на АДФ в реакции, катализируемой карбаматкиназой: карбамоилфосфат + АДФ ® карбамат + АТФ.

Один вид клостридиев (C. cylindrosporum), сбраживающий пурины, способен образовывать формиат и тетрагидрофолат (ТГФК) из формилтетрагидрофолиевой кислоты в реакции, сопровождающейся фосфорилированием АДФ: формил-ТГФК + АДФ + ФН ® формиат + ТГФК + АТФ.

Для этого вида указанная реакция служит основным путем получения АТФ. Все реакции субстратного фосфорилирования локализованы в цитозоле клетки. Это указывает на простоту химических механизмов, лежащих в основе субстратного фосфорилирования. Проблема акцептора электронов

Основная проблема всех процессов брожения — проблема акцептора электронов. В конечном итоге степень окисления и сопряженное с этим количество свободной энергии, а также характер образующихся продуктов определяются природой конечных акцепторов электронов. При брожениях конечными акцепторами электронов служат в основном органические соединения: метаболиты, образующиеся из исходных субстратов (пировиноградная кислота, ацетальдегид), или вещества, имеющиеся в среде культивирования (некоторые аминокислоты и другие органические соединения, способные восстанавливаться). В ряде брожений акцепторами электронов служат молекулы CO2, а также ионы водорода (H2). Кроме того, в отдельных случаях дополнительными акцепторами электронов могут быть некоторые достаточно окисленные неорганические соединения, такие как нитрат, молекулярная сера. Если конечным акцептором электронов является ацетальдегид, образуется этанол, если пируват — молочная кислота. Акцептирование электронов молекулами CO2 приводит у разных видов к возникновению формиата или ацетата, если же эту функцию выполняют ионы водорода, образуется молекулярный водород (H2). Восстановленные соединения, акцептировавшие электроны, выделяются из клеток эубактерий в окружающую среду и накапливаются в ней в значительных количествах. Из-за низкого энергетического выхода процессов брожения для обеспечения энергией всех функций и биосинтетических процессов клетке приходится перерабатывать огромные количества субстратов. Итак, брожение — это способ получения энергии, при котором АТФ образуется в процессе анаэробного окисления органических субстратов в реакциях субстратного фосфорилирования. ГОМОФЕРМЕНТАТИВНОЕ МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Последовательность биохимических реакций, лежащих в основе гомоферментативного молочнокислого брожения, получила название гликолитического пути (гликолиза)41, фруктозодифосфатного пути, или пути Эмбдена — Мейергофа — Парнаса (Н. Embden, О. Meyerhof, Я. О. Парнас), по именам исследователей, внесших больший вклад в изучение этого процесса. Общая схема гомоферментативного молочнокислого брожения представлена на рис. 53.

Рис. 53. Гомоферментативное молочнокислое брожение: Ф1 — гексокиназа; Ф2 — глюкозофосфатизомераза; Ф3 — фофсофруктокиназа; Ф4 — фруктозо-1, 6-дифосфатальдолаза; Ф5 — триозофосфатизомераза; Ф6 — 3-ФГА-дегидрогеназа; Ф7 — фофсоглицерокиназа; Ф8 — фосфоглицеромутаза; Ф9 — енолаза; Ф10 — пируваткиназа; Ф11 — лактатдегиброгеназа (по Dagley, Nicholson, 1973) Основными энергетическими ресурсами для эубактерий, осуществляющих гомоферментативное молочнокислое брожение, служат моносахара (в первую очередь, глюкоза) и дисахара (мальтоза, лактоза). В процессе подготовки к энергетическим преобразованиям дисахара ферментативным путем расщепляются до моносахаров. Различные моносахара, прежде чем подвергнуться преобразованиям, должны превратиться в глюкозо-6-фосфат. Момент унификации, т. е. превращения различных субстратов в один, исходный для дальнейшего его метаболизирования по данному пути, очень важен. От того, что служит исходным энергетическим ресурсом, зависит общий энергетический баланс процесса. 41 Собственно гликолиз — это определенная последовательность ферментативных реакций от углевода до пировиноградной кислоты, поэтому, строго говоря, "гликолиз" не является синонимом "гомоферментативного молочнокислого брожения", но 10 из 11 реакций у этих процессов идентичны. Если исходным энергетическим субстратом служит глюкоза, первое превращение, которому она подвергается, — фосфорилирование. В результате образуется глюкозо-6-фосфат — метаболически активная форма глюкозы. Если исходный энергетический субстрат — лактоза, первым шагом на пути метаболизирования является ферментативное расщепление лактозы с помощью (3-галактозидазы на D-галактозу и D-глюкозу. D-галактоза затем подвергается фосфорилированию, приводящему к образованию D-галактозо-1-фосфата. Последний подвергается серии ферментативных превращений с участием УТФ в качестве кофермента, в результате которых превращается в глюкозо-1-фосфат. У некоторых бактерий из рода Lactobacillus имеется фермент мальтозофосфорилаза, катализирующий реакцию: мальтоза + H3PO4 ® глюкозо-1-фосфат + глюкоза.

В результате этой реакции осуществляется расщепление дисахарида мальтозы на две молекулы глюкозы, одна из которых образуется в фосфорилированной форме. Здесь важно подчеркнуть, что в этой реакции молекула фосфорилированной глюкозы синтезируется без затраты АТФ. Если исходным энергетическим субстратом, вовлекаемым в процесс гликолиза, служит полисахарид типа гликогена или крахмала, его использование начинается с фосфоролитического отщепления глюкозного остатка, протекающего по схеме: (глюкоза)n + HPO42 – ® (глюкоза)n – 1 + глюкозо-1-фосфат.

Глюкозо-1-фосфат, образующийся в результате подготовительных превращений углеводов, иных, чем глюкоза, превращается затем в глюкозо-6-фосфат. Перемещение фосфатной группы из положения 1 в положение 6 катализируется ферментом фосфоглюкомутазой. Дальнейшее превращение глюкозо-6-фосфата одинаково независимо от исходного энергетического субстрата (рис. 53). Молекула глюкозо-6-фосфата изомеризуется в молекулу фруктозо-6-фосфата. Последний фосфорилируется в положении 1. Донором фосфата служит АТФ. Вторичное фосфорилирование молекулы фруктозы приводит к ее дальнейшему активированию. Образовавшийся фруктозо-1, 6-дифосфат разрывается на две триозы: фосфодиоксиацетон и 3-ФГА. Разрыв катализируется фруктозо-1, 6-дифосфатальдолазой (альдолазой), являющейся ключевым ферментом этого пути. Достаточно обнаружить альдолазу, чтобы получить свидетельство существования гликолитического пути у организма. В последующие реакции может включаться только 3-ФГА. Фосфодиоксиацетон превращается в 3-ФГА в реакции изомеризации, катализируемой триозофосфатизомеразой. На этом этапе заканчивается подготовительная стадия гликолитического пути: молекула глюкозы после активирования и расщепления на 2 фосфотриозы подготовлена для последующих превращений. Для активирования 1 молекулы глюкозы тратятся 2 молекулы АТФ42. Таким образом, до сих пор процесс протекает с затратой энергии. Однако его смысл и назначение заключаются в обеспечении клетки энергией. Эта задача решается на следующей стадии. Окисление 3-ФГА до 1, 3-дифосфоглицериновой кислоты — один из наиболее важных этапов гликолитического пути, поскольку именно на этом этапе энергия, освобождающаяся при окислении альдегидной группы 3-ФГА, запасается в молекуле 1, 3-ФГК. Реакция катализируется ферментом 3-ФГА-дегидрогеназой: 3-ФГА + НАД+ + ФН ® 1, 3-ФГК + НАД-H2.

3-ФГА служит донором электронов, которые переходят на НАД+ функционирующий в качестве переносчика электронов от 3-ФГА к пировиноградной кислоте. Образование последней происходит на более поздних этапах гликолитического пути. Итак, альдегидная группа 3-ФГА окисляется до карбоксильной группы. Однако вместо свободной карбоновой кислоты образуется смешанный ангидрид фосфорной кислоты и карбоксильной группы 3-ФГК — 1, 3-ФГК. Реакция окисления 3-ФГА до 1, 3-ФГК с помощью НАД-зависимой 3-ФГА-дегидрогеназы состоит из нескольких этапов, в результате чего энергия, освобождающаяся при окислении 3-ФГА, запасается в макроэргической фосфатной связи у первого углеродного атома 1, 3-ФГК. 1, 3-ФГК реагирует далее с АДФ, отдавая высокоэнергетическую фосфатную группу, что приводит к синтезу молекулы АТФ. Таким образом, энергия, высвободившаяся при окислении альдегидной группы, оказывается запасенной в молекуле АТФ. 42 Если исходным субстратом служит полисахарид, например гликоген или крахмал, для активирования глюкозного остатка на подготовительной стадии гликолитического пути затрачивается только 1 молекула АТФ. Итак, произошло образование 3-ФГК. Теперь можно подвести некоторые итоги. Клетка на этом этапе "вернула" свои энергетические затраты: 2 молекулы АТФ были затрачены и 2 молекулы АТФ синтезировались на 1 молекулу глюкозы. На этом же этапе в реакции окисления 3-ФГА до 1, 3-ФГК и образования АТФ имеет место первое субстратное фосфорилирование. Энергия освобождается и запасается в макроэргических фосфатных связях АТФ в процессе перестройки сбраживаемого субстрата при участии ферментов. Реакция, ведущая к субстратному фосфорилированию, может быть проведена в пробирке. Все необходимые для этого компоненты известны и получены в чистом виде. Возможность осуществления реакции в пробирке указывает на то, что фермент, катализирующий ее, не связан с клеточными структурами. Первое субстратное фосфорилирование носит еще название фосфорилирования на уровне 3-ФГА. После образования 3-ФГК фосфатная группа из третьего положения переносится во второе. Далее происходит отщепление молекулы воды от второго и третьего атомов углерода 2-ФГК, катализируемое ферментом енолазой, и образуется фосфоенолпировиноградная кислота. В результате происшедшей дегидратации молекулы 2-ФГК степень окисления ее второго углеродного атома увеличивается, а третьего — уменьшается. Таким образом, данная реакция по существу представляет собой внутримолекулярный окислительно-восстановительный процесс. Дегидратация молекулы 2-ФГК, приводящая к образованию ФЕП, сопровождается перераспределением энергии внутри молекулы, в результате чего фосфатная связь у второго углеродного атома из низкоэнергетической в молекуле 2-ФГК превращается в высокоэнергетическую в молекуле ФЕП. Молекула ФЕП становится донором богатой энергией фосфатной группы, которая переносится на АДФ с помощью фермента пируваткиназы. Таким образом, в процессе превращения 2-ФГК в пировиноградную кислоту имеет место высвобождение энергии и запасание ее в молекуле АТФ. Это второе субстратное фосфорилирование. По ряду черт оно отличается от первого субстратного фосфорилирования: 1) если в первом случае образование макроэргической фосфатной связи протекало одновременно с присоединением к субстрату фосфатной группы, то во втором — фосфатная группа была присоединена к молекуле субстрата задолго до этого события; 2) первое субстратное фосфорилирование связано с реакцией окисления, приводящей к тому, что от молекулы 3-ФГА отрываются два электрона и переходят на НАД+, т. е. молекула 3-ФГА служит донором электронов, но вопрос о конечном акцепторе их на этом этапе не решен. Напротив, при втором субстратном фосфорилировании, связанном с реакцией дегидратации молекулы 2-ФГК, решается проблема и донора и акцептора. Здесь в результате внутримолекулярного окислительно-восстановительного процесса одна молекула и донирует и акцептирует электроны. В процессе второго субстратного фосфорилирования образуется еще молекула АТФ; в итоге общий энергетический выигрыш процесса составляет 2 молекулы АТФ на 1 молекулу глюкозы. Такова энергетическая сторона процесса гомоферментативного молочнокислого брожения. Однако осталась еще проблема восстановленного переносчика — НАД-H2, образованного в реакции окисления 3-ФГА. Чтобы процесс продолжался, в метаболический поток необходимо вернуть этот метаболит в окисленном виде (НАД+), т. е. решить проблему конечного акцептора. Как же она решается в данном случае? Результатом рассмотренного выше процесса, помимо его энергетического итога, является образование 2 молекул пировиноградной кислоты и 2 молекул НАД-H2 на 1 молекулу сброженной гексозы. Молекула пировиноградной кислоты по своему химическому строению — достаточно окисленное соединение и может служить акцептором электронов. В этом случае донор-акцепторная проблема решена самым простым способом: 2 электрона переносятся с НАД-H2 на молекулу пировиноградной кислоты, что приводит к образованию молочной кислоты. Суммарно процесс можно выразить в виде следующего уравнения: глюкоза + 2ФН + 2АДФ ® 2 молочная кислота + 2АТФ + 2H2O.

Гомоферментативное молочнокислое брожение представляет собой энергетическую сторону образа жизни группы гомоферментативных молочнокислых бактерий. Черты древности этой группы видны не только в процессе добывания ее представителями энергии, но и в других сторонах их метаболизма, о чем будет сказано в разделе, посвященном краткой характеристике этих бактерий. Сейчас же остается подвести некоторые итоги рассмотренного процесса и оценить его "судьбу". В процессе гомоферментативного молочнокислого брожения имеют место 3 типа химических превращений: перестройка углеродного скелета исходного субстрата;

окислительно-восстановительные превращения;
образование АТФ.

Энергетический выход процесса таков: образование 2 молекул АТФ на молекулу глюкозы43. Энергетическая эффективность процесса, т. е. эффективность запасания выделяемой свободной энергии в молекулах АТФ, составляет примерно 40%. Энергия запасается только в реакциях субстратного фосфорилирования. Как можно видеть из суммирования энергетических характеристик процесса, низкий энергетический выход сочетается в нем с высокой энергетической эффективностью, а в основе всего лежат простые механизмы получения энергии. Окислительно-восстановительные превращения имеют место на двух этапах процесса, именно они приводят к получению клеткой энергии. Если оценить общин окислительно-восстановительный . баланс процесса (C6H12O6 ® 2C3H6O3), можно видеть, что суммарного изменения степени окисленности при этом не происходит (если сравнить степень окисленности отдельных углеродных атомов глюкозы и молочной кислоты, получается другая картина). Это результат того, что процесс "замкнут на себя", т. е. субстрат является и источником веществ — доноров электронов и источником веществ — их акцепторов. "Замкнутость" процесса приводит к ограничению его окислительных и, следовательно, энергетических возможностей (но в данном конкретном случае еще не исчерпывает их). Все это, вместе взятое, определило "судьбу" гомоферментативного молочнокислого брожения. 43 Если исходный субстрат — полисахарид, образуются 3 молекулы АТФ на 1 молекулу сброженной глюкозы. Возникнув как первый, далекий от совершенства энергетический процесс, гомоферментативное молочнокислое брожение не было потом отброшено в процессе эволюции. Наоборот, оно закрепилось и существует сейчас в виде гликолиза у подавляющего большинства прокариот, дрожжей, грибов, а также у высших животных и растений, но только как первый этап более совершенного энергетического процесса, сформировавшегося в результате последующего развития способов получения энергии живыми организмами. Чем объясняется такая судьба гомоферментативного молочнокислого брожения? Вероятно, оказалось выгодным использовать его в качестве первого подготовительного этапа по следующим причинам: 1) высокая энергетическая эффективность (не путать с энергетическим выходом процесса! ); 2) простота механизмов получения энергии; 3) перестройка исходного субстрата в форму, метаболически удобную для последующих превращений. ГОМОФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ

Гомоферментативное молочнокислое брожение, в основе которого лежит гликолитический путь разложения глюкозы, является единственным способом получения энергии для группы эубактерий, которые при сбраживании углеводов превращают в молочную кислоту от 85 до 90% сахара среды. Бактерии, входящие в данную группу, морфологически различны. Это кокки, относящиеся к родам Streptococcus и Pediococcus, а также длинные или короткие палочки из рода Lactobacillus. Последний подразделяется на три подрода. Бактерии, включенные в два из них (Thermobacterium, Streptobacterium), также осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Все бактерии этой группы положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны. Группа весьма гетерогенна в отношении нуклеотидного состава ДНК: молярное содержание ГЦ-пар оснований колеблется от 32 до 51%. Значительные колебания по этому признаку характерны и для бактерий, объединенных в роды и даже подроды. Лактатдегидрогеназа, катализирующая превращение пирувата в лактат, стереоспецифична. У разных видов она содержится в виде определенных оптических изомеров; в зависимости от этого бактерии продуцируют D- или L-форму молочной кислоты. Те из них, которые образуют смесь D- и L-форм. содержат или две формы фермента, различающиеся стереоспецифичностью, или лактатрацемазу. Некоторые признаки, характерные для эубактерий, осуществляющих гомоферментативное молочнокислое брожение, представлены в табл. 15. Таблица 15. Характеристика таксономических групп гомоферментативных молочнокислых бактерий Род и подрод бактерий

    Морфология и особенности деления клеток
    Молярное содержание ГЦ в ДНК, %
    Конфигурация молочной кислоты
    Наиболее распространенные виды
    Род Streptococcus

сферические или овальные клетки; делятся в одной плоскости, в результате образуются пары или цепочки клеток 33—44

    D
    S. faecalis
    S. lactis
    Род Pediococcus

кокки; делятся в двух плоскостях, в результате образуются тетрады клеток 33—44

    DL
    P. cerevisiae
    Род Lactobacillus
      Подрод Thermobacterium
      Подрод Streptobacterium*

палочки; делятся в одной плоскости, образуют пары или цепочки клеток 35—51

    32—46
    L
    D
    D
    DL
    DL
    L
    L. delbruckii
    L. bulgaricus
    L. lactis
    L. jensenii
    L. plantarum
    L. casei

* Виды, относящиеся к этому подроду, расщепляют пентозы по окислительному пентозофосфатному пути, осуществляя гетероферментативное молочнокислое брожение. Поэтому они не являются облигатно гомоферментативными молочнокислыми бактериями. У этой группы эубактерий молекулярный кислород не включается в энергетический метаболизм, но они способны расти в присутствии O2, т. е. являются аэротолерантными анаэробами44. В их клетках в значительном количестве содержатся флавиновыe ферменты, с помощью которых происходит восстановление молекулярного кислорода до H2O2. Из-за неспособности молочнокислых бактерий синтезировать гемовую группу у них отсутствует каталаза — фермент, катализирующий разложение перекиси водорода, поэтому последняя может накапливаться в клетке. Существующие механизмы защиты от молекулярного кислорода и его производных у этой группы эубактерий изложены в гл. 15. 44 Некоторые авторы представителей рода Lactobacillus относят к микроаэрофилам (см. сноску на с. 127). Особенностями конструктивного метаболизма гомоферментативных молочнокислых бактерий являются слабо развитые биосинтетические способности, что выражается в большой зависимости их роста от наличия в питательной среде готовых органических веществ (аминокислоты, витамины группы В, пурины, пиримидины). В качестве источника углерода молочнокислые бактерии используют лактозу (молочный сахар) или мальтозу (растительный сахар, образующийся при гидролизе крахмала). Могут они также использовать некоторые пентозы, сахароспирты и органические кислоты. Из всех известных непатогенных прокариот молочнокислые бактерии отличаются наибольшей требовательностью к субстрату. Зависимость этих бактерий от наличия готовых органических веществ среды указывает на примитивность в целом их конструктивного метаболизма. Молочнокислые бактерии распространены там, где они могут обеспечить свои высокие потребности в питательных веществах и где имеются большие количества углеводов, переработка которых дает им необходимую для роста энергию. Их много в молоке и молочных продуктах, на поверхности растений и в местах разложения растительных остатков; обнаружены они в пищеварительном тракте и на слизистых оболочках животных и человека. Молочнокислым бактериям принадлежит главная роль в осуществлении ряда процессов, используемых с давних времен для получения различных кисломолочных продуктов, в процессах соления и квашения овощей, силосования кормов. Кефир — продукт совместной деятельности молочнокислых бактерий и дрожжей. Известно много национальных кисломолочных продуктов (кумыс, йогурт и др. ), для приготовления которых используют кобылье, верблюжье, овечье, козье молоко, а в качестве закваски — естественно возникшие и сохраняемые комплексы молочнокислых бактерий и дрожжей. Молочнокислые бактерии играют также большую роль в процессе приготовления сыров и сливочного масла. Первый этап производства сыров (створаживание белков молока) осуществляется молочнокислыми бактериями. Скисание сливок, необходимое для получения сливочного масла, также вызывают бактерии рода Streptococcus. Помимо молочной кислоты некоторые из них образуют ацетоин и диацетил, придающие сливочному маслу характерный запах и вкус Субстратом служит лимонная кислота, содержание которой в молоке может достигать 1 г/л. Реакции, ведущие к образованию этих веществ, начинаются с расщепления лимонной кислоты: лимонная кислота ® уксусная кислота + щавелевоуксусная кислота Уксусная кислота выделяется в среду, а щавелевоуксусная кислота (ЩУК) декарбоксилируется, что приводит к образованию пирувата: ЩУК ® пировиноградная кислота + CO2 (1).

Дальнейшее метаболизирование пирувата осуществляется по трем различным путям: часть молекул восстанавливается до молочной кислоты; другая часть подвергается декарбоксилированию, приводящему к возникновению разных C2-интермедиатов (ацетил-КоА и "активный" ацетальдегид) и взаимодействию между ними, заканчивающемуся синтезом молекулы диацетила. Восстановление последнего приводит к образованию ацетоина: CH3-CO-CO-CH3

    +
    НАД-H2
    ®
    CH3-CHOH-CO-CH3
    +
    НАД+
       (2).
    диацетил



    ацетоин

Эта последовательность реакций не связана с получением клеткой энергии. Смысл ее, возможно, в дополнительном своеобразном решении "акцепторной проблемы", так как, во-первых, образование пирувата в реакции 1 не сопровождается синтезом НАД-H2, и, во-вторых, синтез ацетоина из диацетила (реакция 2) требует дополнительных молекул НАД-H2. Использующие мальтозу молочнокислые бактерии участвуют в квашении овощей. В мелко нарезанные овощи добавляют 2 — 3% соли и создают условия, исключающие свободный доступ воздуха. Начинается спонтанное молочнокислое брожение. Аналогичный процесс протекает при силосовании кормов. Предназначенная для силосования растительная масса плотно загружается в силосные башни или ямы. Чтобы повысить питательные свойства среды, добавляют мелассу, а с целью создания более благоприятных условий для молочнокислых бактерий растительную массу подкисляют. В этих условиях также протекает спонтанное молочнокислое брожение. СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ

Выше мы разобрали наиболее простой способ решения донор-акцепторной проблемы, который реализуется в виде молочнокислого брожения у группы гомоферментативных молочнокислых бактерий. Дальнейшие поиски на путях эволюции привели к формированию других метаболических возможностей для решения этой проблемы. Одна из них заключается в том, что из пировиноградной кислоты в результате ее окислительного декарбоксилирования образуется, ацетальдегид, который становится конечным акцептором водорода. В итоге из 1 молекулы гексозы образуются 2 молекулы этилового спирта и 2 молекулы углекислоты. Процесс получил название спиртового брожения. Спиртовое брожение распространено среди прокариотных (различные облигатно и факультативно анаэробные эубактерии) и эукариотных (дрожжи) форм. В анаэробных условиях у высших растений также отмечено накопление этилового спирта. Процесс спиртового брожения, осуществляемый дрожжами, до последней реакции идет по тому же пути, что и описанный выше процесс молочнокислого брожения, но последняя реакция заменена двумя другими ферментативными реакциями. Сначала пируват с помощью пируватдекарбоксилазы, ключевого фермента спиртового брожения, декарбоксилируется до ацетальдегида и CO2: CH3-CO-COOH ® CH3-COH + CO2 .

Особенность реакции заключается в ее полной необратимости. Образовавшийся ацетальдегид восстанавливается до этанола с участием НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы: CH3-COH + НАД-H2 ® CH3-CH2OH + НАД+

Донором водорода служат 3-ФГА (как и в случае молочнокислого брожения). Процесс спиртового брожения суммарно можно выразить следующим уравнением: C6H12O6 + 2ФН + 2АДФ ® 2CH3-CH2OH + 2CO2 + 2АТФ +2H2O.

Как видно из уравнения, с точки зрения энергетического выхода оба процесса (гомоферментативное молочнокислое и спиртовое брожение) одинаковы. В обоих случаях сбраживание 1 молекулы глюкозы приводит к образованию 2 молекул АТФ. Процессы различаются природой конечных акцепторов электронов. Кроме того, если при гомоферментативном молочнокислом брожении образовавшаяся молочная кислота в целом по степени окисленности-восстановленности не отличается от молекулы гексозы (имеет место лишь внутримолекулярное перераспределение окисленности и восстановленности отдельных углеродных атомов, входящих в ее молекулу), то в случае спиртового брожения происходит межмолекулярное размежевание на восстановленные (этиловый спирт) и окисленные (CO2) молекулы. Спиртовое брожение, осуществляемое дрожжами, интересно тем, что на нем впервые были сделаны открытия, имеющие принципиальное значение. Именно при изучении спиртового брожения Л. Пастер доказал, что оно является процессом, связанным с жизнедеятельностью определенных микроорганизмов — дрожжей. Л. Пастер открыл, что в условиях свободного доступа кислорода воздуха процесс спиртового брожения ингибируется и активируется дыхание. Это явление получило название "эффекта Пастера". "Эффект Пастера" есть результат определенного взаимодействия между различными энергетическими путями, существующими у дрожжей. Одним из проявлений такого взаимодействия является конкуренция за АДФ и неорганический фосфат между процессами субстратного фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. В 1897 г. братья Г. и Э. Бухнеры (Н. Buchner, E. Buchner) опубликовали первое сообщение о возможности осуществления спиртового брожения вне клетки. Оказалось, что бесклеточные экстракты дрожжей превращают углеводы в этанол. Это послужило отправным пунктом для детального изучения химизма процесса. Впервые было показано включение неорганического фосфора в этот процесс и роль фосфорилированных соединений (Л. А. Иванов, 1905; A. Harden, W. Young, 1905). Установлена природа отдельных реакций, катализирующих их ферментов, промежуточных продуктов метаболизма, коферментов, энергетических взаимопревращений. В 1933г. Г. Эмбден и О. Мейергоф предложили полную схему спиртового брожения. Наконец, работы К. Нойберга (К. Neuberg) по изучению механизма спиртового брожения привели к установлению еще одной важной особенности метаболизма низших форм жизни — его чрезвычайной гибкости. К. Нойберг обнаружил, что в зависимости от условий процесс спиртового брожения может идти с образованием продуктов, которые в норме не образуются. Если к дрожжам, сбраживающим глюкозу, добавить бисульфит, то основным продуктом брожения будет глицерин. Оказалось, что бисульфит образует комплекс с ацетальдегидом, и последний не может больше функционировать как акцептор электронов:

Следствием этого является передача электронов от НАД-H2 на фосфодиоксиацетон, восстановление его до 3-фосфоглицерина и дефосфорилирование последнего, приводящее к образованию глицерина. Кроме глицерина в среде происходит накопление ацетальдегида (в комплексе с бисульфитом), этанола и CO2, но образование последних двух продуктов заметно подавлено. Когда брожение идет в присутствии бисульфита, энергетический выход процесса в два раза меньше по сравнению с нормальным спиртовым брожением, поскольку одна триоза не подвергается окислению, а восстанавливается до молекулы глицерина. Спиртовое брожение протекает обычно при pH 3–6. Если его проводить в щелочной среде, например в присутствии NaHCO3, также происходит накопление в сбраживаемом растворе глицерина. Оказалось, что в щелочных условиях ацетальдегид не может акцептировать электроны, поскольку в этих условиях он участвует в реакции дисмутации с образованием уксусной кислоты и этилового спирта. Акцептором электронов, как и в предыдущем случае, служит фосфодиоксиацетон. Процесс брожения в щелочной среде можно представить в виде следующего уравнения: 2C6H12O6

    ®
    2C3H8O3
    +
    CH3-COOH
    +
    CH3-CH2OH
    +
    2CO2.
    глюкоза

    глицерин

    уксусная кислота

    этиловый спирт


    МИКРООРГАНИЗМЫ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ

Накопление этилового спирта в среде в анаэробных условиях наблюдается у разных групп эубактерий и группы эукариотных микроорганизмов — дрожжей. Эубактерии

Способность осуществлять в анаэробных условиях спиртовое брожение по пути, описанному в предыдущем разделе, присуща некоторым эубактериям, принадлежащим к разным таксономическим группам, например Sarcina ventriculi, Erwinia amylovora. S. ventriculi относится к группе грамположительных анаэробных кокков. Клетки неподвижные; делятся в трех плоскостях, поэтому в культуре часто образуют пакеты, состоящие из 64 и более клеток. Веществом, связывающим клетки в пакетах, служит целлюлоза. Описана способность образовывать эндоспоры. Аэротолерантный анаэроб. Единственный способ получения энергии — сбраживание Сахаров. Потребность в питательных веществах довольно высока (многочисленные аминокислоты и ряд витаминов). E. amylovora относится к группе энтеробактерий. Это грамотрицательные подвижные палочки. Особенностью вида является его патогенность для растений. Факультативный анаэроб. В аэробных условиях получает энергию в процессе дыхания. Помимо этилового спирта и CO2 в качестве продуктов брожения S. ventriculi в среде накапливается уксусная кислота и выделяется молекулярный водород, у E. amylovora накапливается молочная кислота. Разнообразие конечных продуктов у этих бактерий связано с тем, что пируват, образующийся при сбраживании глюкозы по гликолитическому пути, далее может метаболизироваться различно: восстанавливаться до молочной кислоты; подвергаться декарбоксилированию и последующему восстановлению, как описано в предыдущем разделе; подвергаться ферментативному расщеплению, приводящему к образованию ацетата и др. У многих клостридиев и энтеробактерий среди продуктов брожения обнаруживают этиловый спирт, но путь его образования отличен от описанного в предыдущем разделе. Сбраживание сахаров до пировиноградной кислоты происходит по гликолитическому пути, дальнейшее же превращение пирувата идет не через пируватдекарбоксилазу. У названных групп бактерий пируват подвергается расщеплению, приводящему к образованию ацетил-КоА. Реакция катализируется пируватдегидрогеназой. Ацетил-КоА затем восстанавливается до ацетальдегида: CH3-CO~S-КоА + НАД-H2 ® CH3-COH + НАД+ + КоА-SH,

а последний — до этанола.

Гетероферментативные молочнокислые бактерии накапливают в среде спирт, метаболизируя глюкозу по окислительному пентозофосфатному пути. В результате ряда ферментативных превращений образуется ацетилфосфат, восстановление которого в два этапа приводит к появлению молекулы этилового спирта. Наконец, у бактерий Zymomonas mobilis с неясным систематическим положением, используемых в Мексике для получения национального спиртного напитка "пульке", разложение глюкозы до пировиноградной кислоты идет по пути Энтнера — Дудорова. Дальнейшее превращение пирувата происходит с участием пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Выход продуктов брожения такой же, как при спиртовом брожении по гликолитическому пути: по 2 молекулы спирта и CO2 на 1 молекулу сброженной глюкозы, но энергетический выход в два раза ниже, чем при гликолизе: всего 1 молекула АТФ на 1 молекулу сброженной глюкозы. Z. mobilis — грамотрицательные подвижные бактерии, имеющие форму коротких палочек. Характеризуются высокими биосинтетическими способностями. Анаэробы, единственный способ получения энергии для которых — спиртовое брожение. Однако эти бактерии способны расти в присутствии молекулярного кислорода. Последний в этом случае используется для окисления части этанола до уксусной кислоты в соответствии с уравнением: 1 глюкоза + 1O2 ® 1 этиловый спирт + 1 уксусная кислота + 1, 7CO2 + 0, 2 молочная кислота Таким образом, молекулярный кислород существенно не меняет характера энергетического метаболизма Z. mobilis. В клетках бактерии обнаружены фрагменты ЦТК, цитохромы b, c, a2, каталаза. Наиболее вероятным представляется, что предки Z. mobilis — аэробы. Способ получения энергии за счет спиртового брожения — более позднее приспособление к условиям обитания. Эукариоты

Основными продуцентами этилового спирта, имеющими широкое практическое применение, являются дрожжи — одноклеточные эукариотные микроорганизмы, принадлежащие к разным классам высших грибов. Наиболее распространенный способ размножения дрожжей — почкование. Дрожжи — аэробы со сформированным аппаратом дыхания, но в анаэробных условиях осуществляют спиртовое брожение по пути, рассмотренному в предыдущем разделе, т. е. получают энергию за счет субстратного фосфорилирования. Конструктивный метаболизм дрожжей основан на их хорошо развитых биосинтетических способностях. Есть виды дрожжей, развивающиеся на простых синтетических средах; эти дрожжи способны синтезировать все необходимые им сложные органические соединения. Существуют виды, . нуждающиеся в определенных витаминах группы В. Добавление к питательной среде веществ, содержащих комплекс витаминов, аминокислот, сахаров приводит, как правило, к заметному стимулированию роста дрожжей. Ряд отраслей промышленности основан на жизнедеятельности дрожжей (виноделие, производство спирта, пивоварение, хлебопекарное производство). Сырьем для производства спирта с использованием дрожжей служат углеводы растительного происхождения (картофель, злаки), отходы пищевой (мелассы) и целлюлозно-бумажной (щелока) промышленности, различные сельскохозяйственные отходы, а также гидролизаты древесины. Сбраживание дрожжами виноградного сока лежит в основе виноделия; сбраживание пивного сусла, приготовленного из проросших зерен ячменя, специальными пивными дрожжами — в основе пивоварения. О путях образования этилового спирта

Изложенные данные позволяют составить определенное представление о том, насколько широко распространено образование этилового спирта среди разных групп эубактерий и насколько различны метаболические пути, ведущие к его синтезу. Из этого следует, что накопление в культуральной среде этилового спирта само по себе не может служить указанием на место процесса, приводящего к его образованию, в эволюции. Этиловый спирт у эубактерий может быть одним из конечных продуктов как эволюционно более ранних (гликолиз), так и более поздних (окислительный пентозофосфатный цикл, путь Энтнера — Дудорова) катаболических процессов. До сих пор среди эубактерий не обнаружены организмы, сохранившие черты примитивности энергетического и конструктивного метаболизма, у которых спиртовое брожение служило бы единственным способом получения энергии. Тот факт, что в самом "классическом" виде спиртовое брожение проявляется у дрожжей, форм эукариотных, не может, как нам кажется, ставить под сомнение его место в эволюции анаэробных энергетических процессов. ПРОПИОНОВОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Из рассмотренных двух типов брожения видно, что ключевым соединением в обоих процессах является пируват, поскольку в конечном итоге специфика брожения определяется дальнейшей судьбой пирувата. Основная задача последующих реакций — регенерирование молекулы НАД+ и возвращение ее в клеточный метаболизм. Прямое восстановление пирувата с помощью НАД-H2 до молочной кислоты реализуется в молочнокислом брожении. Другая возможность регенерирования НАД+ — "сбрасывание" водорода с НАД-H2 на фрагменты, образуемые при метаболизме пирувата, — имеет место в спиртовом брожении, осуществляемом дрожжами и некоторыми видами бактерий. Третья возможность связана с синтетическим процессом — усложнением молекулы пирувата, в результате которого создается более окисленная молекула акцептора, способная принять больше электронов с восстановленных переносчиков. Это происходит при присоединении к молекуле пирувата CO2, приводящем к формированию четырехуглеродного скелета. Процесс получил название гетеротрофной ассимиляции углекислоты.

Рис. 54. Превращение пировиноградной кислоты в пропионовую при пропионовокислом брожении: Ф1 — метилмалонил-КоА-карбоксилтрансфераза; Ф2 — малатдегидрогеназа; Ф3 — фумараза: Ф4 — фумаратредуктаза; Ф5 — КоА-трансфераза; Ф6 — метилмалонил-КоА-мутаза (по Daglev, Nicholson. 1973; Rose. 1971) Впервые гетеротрофная ассимиляция углекислоты была обнаружена в 1936 г. X. Вудом и К. Веркманом (Н. Wood, C. Werkman) при изучении сбраживания глицерина пропионовыми бактериями. Карбоксилирование пирувата, приводящее к образованию щавелевоуксусной кислоты, получило название реакции Вуда — Веркмана. У эубактерий обнаружены различные реакции карбоксилирования пирувата или его фосфорилированного производного. Показано, что реакции карбоксилирования имеют место у всех гетеротрофных прокариот, а также в клетках всех эукариотных организмов, включая высшие растения и животных. Кроме того, в больших масштабах в природе реакции связывания CO2 осуществляются автотрофными. организмами в процессе хемо- и фотосинтеза. В пропионовокислом брожении мы имеем дело с реализацией третьей возможности превращения пирувата — его карбоксилированием, приводящим к возникновению нового акцептора водорода — ЩУК. Восстановление пировиноградной кислоты в пропионовую у пропионовокислых бактерий протекает следующим образом (рис. 54). Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика CO2. Донором CO2-группы служит метилмалонил-КоА. В результате реакции транскарбоксилирования образуются ЩУК и пропионил-КоА:

Рассмотрим теперь дальнейшую судьбу каждого из двух продуктов реакции, а также вопрос о происхождении одного из субстратов реакции — метилмалонил-КоА. (Основным источником пировиноградной кислоты служит процесс гликолитического расщепления гексоз или окислительные превращения, если в качестве субстрата брожения используют, например, диоксиацетон или глицерин. ) ЩУК в результате трех ферментативных этапов (аналогичных реакциям 6, 7, 8 цикла трикарбоновых кислот, см. рис. 92) превращается в янтарную кислоту:

Следующая реакция заключается в переносе КоА-группы с пропионил-КоА на янтарную кислоту (сукцинат), в результате чего образуется сукцинил-КоА и пропионовая кислота:

Образовавшаяся пропионовая кислота выводится из процесса и накапливается вне клетки. Сукцинил-КоА превращается в метилмалонил-КоА:

В состав кофермента метилмалонил-КоА-мутазы входит витамин B12. Перегруппировки типа, указанного в приведенном выше уравнении, характерны для реакций, катализируемых ферментами, содержащими витамин B12. В описанной выше реакции происходящие перемещения атомов в молекуле сводятся к двум типам: изменению углерод-углеродных связей и перераспределению водорода между углеродными атомами (рис. 55). Реакция, катализируемая мутазой, — ключевая в пропионовокислом брожении, так как в ней подготавливается субстрат, являющийся предшественником пропионовой кислоты. Из схемы, представленной на рис. 54, можно видеть, что образование пропионовой кислоты из пировиноградной — результат взаимосвязанного функционирования двух циклов: цикла переноса одноуглеродного фрагмента и цикла переноса кофермента А.

Рис. 55. Механизм реакции, катализируемой метилмалонил-КоА-мутазой. Цифрами в кружочках пронумерованы атомы углерода Кофермент А, принимающий активное участие в пропионовокислом брожении, относится к группе мононуклеотидов. Он содержит аденин, Д-рибозу, пирофосфатную группу и пептидоподобное соединение, в состав которого входит пантотеновая кислота — еще один витамин группы В. Функция кофермента А заключается в переносе ацильных групп (RCO~). Ацильная форма КоА представляет собой тиоэфир. Тиоэфирная связь, образующаяся между карбоксильной группой кислоты и тиоловой группой КоА, является высокоэнергетической. Итак, разобранный выше поток реакций приводит к синтезу пропионовой кислоты. Однако пропионовокислое брожение — более сложный процесс, поскольку наряду с пропионовой кислотой в качестве продуктов брожения образуются уксусная, янтарная кислоты и CO2. В схеме, изображенной на рис. 54, янтарная кислота образуется как промежуточное соединение на пути, ведущем к синтезу пропионата; но она может накапливаться в среде и как конечный продукт. К образованию сукцината, количество которого зависит от содержания CO2 в среде, ведет последовательность реакций, начинающаяся с карбоксилирования ФЕП (рис. 56), в которой остаток фосфорной кислоты ФЕП переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию пирофосфата: ФЕП + CO2 + ФН ® ЩУК + пирофосфат.

Страницы: 1, 2