Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации

Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации

Реферат.

Дипломная работа на тему: «Биохимические показатели крови человека

при сальмонеллезной интоксикации» содержит 46 страниц печатного текста,

таблиц, 8 рисунков, 59 использованных источников литературы, из них 10

иностранных.

Перечень ключевых слов: сальмонеллез, перекисное окисление липидов,

циркулирующие иммунные комплексы, каталаза, молекулы средней массы,

сывороточный альбумин, эндогенная интоксикация.

Объект исследования: сыворотка крови практически здоровых людей и

больных сальмонеллезом г. Пензы.

Практическое применение: в здравоохранении.

Список сокращений.

ПОЛ – перекисное окисление липидов;

ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы;

ЧСА – человеческий сывороточный альбумин;

МДА – малоновый диальдегид;

ПЭГ – полиэтиленгликоль;

АОС – антиокислительная способность;

АТ – антитело;

АГ – антиген;

ИК – иммунный комплекс;

ЛПС – липополисахаридный комплекс;

МСМ – молекулы средней массы;

ТБК – тиобарбитуровая кислота;

ЭКА – эффективная концентрация альбумина;

ОКА – общая концентрация альбумина;

ТХУ – трихлоруксусная кислота;

ЦНС – центральная нервная система;

ц-АМФ – циклический аденозинмонофосфат;

АФК – активные формы кислорода;

LOOH, HOOH – гидроперекиси;

СОД – супероксиддисмутаза.

Содержание.

|Введение……………………………………………………………….. |5-6 |

| | |

|Обзор литературы ………………………………………………... |7-19 |

|Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной | |

|инфекции…………………………..…….. |7-11 |

|Молекулярные механизмы развития эндогенной | |

|интоксикации при сальмонеллезе……………………..….. |11-14 |

|Показатели уровня эндогенной интоксикации | |

|организма при сальмонеллезе………………………………. |14-19 |

| | |

|Материалы и методы исследования…………………………. |20-25 |

|Материалы исследования……………………………………. |20 |

|Методы исследования………………………………………… |20-25 |

| | |

|Результаты и обсуждение………………………………….…… |26-34 |

|Определение показателей уровня интоксикации в | |

|сыворотке крови практически здоровых людей…….. |26-27 |

|Определение показателей уровня интоксикации в | |

|сыворотке крови больных сальмонеллезом………….….. |28-34 |

| | |

|Список использованных источников……………………….….. |35-40 |

| | |

|Выводы…………………………………………………………………. |41 |

| | |

|Приложения……………………………………………………………. |42-46 |

Введение

Успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями в нашей стране

общепризнанны. Вместе с тем в инфектологии еще остаются проблемы, имеющие

серьезное социально-экономическое значение для всех стран мира. К их числу

относятся острые кишечные инфекционные заболевания [1].

Сальмонеллез – группа острых кишечных инфекционных болезней,

вызываемых бактериями рода Salmonella, характеризующихся значительным

полиморфизмом клинического течения, частым наличием интоксикации,

лихорадки, признаков поражения желудочно-кишечного тракта [2].

Крупные достижения отечественных и зарубежных исследователей,

установивших патогенетическое значение нарушения биологической регуляции

при острых кишечных инфекциях, дали новый импульс в изучении патогенеза

сальмонеллеза [3].

Иммунная система представляет собой сложную многокомпонентную систему

из быстроделящихся и покоящихся клеток. Она является высокочувствительной к

воздействию токсинов бактерий. Это приводит к нарушению иммунорегуляторных

процессов.

Наиболее информативными являются показатели состояний прооксидантно-

антиоксидантного равновесия, которое при усилении действия на организм

токсинов смещается в сторону активизации ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, Ит,

МСМ.

ПОЛ – это фундаментальный универсальный молекулярный механизм,

лежащий в основе устойчивости и адаптационных возможностей организма. В

норме ПОЛ обеспечивает условие для жизненно важных функций клетки, в случае

же интоксикации становится пусковым механизмом патобиохимических изменений

в организме человека.

Целью моей дипломной работы является изучение биохимических

показателей эндотоксикоза в динамике патологического процесса. В задачи

исследования входило:

1. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и

активности каталазы в группе контроля, которую составили практически

здоровые люди.

2. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и

активности каталазы у больных сальмонеллезом.

3. Исследование изменения изучаемых показателей у больных в зависимости

от степени тяжести заболевания.

1. Обзор литературы

1. Биохимическая характеристика интоксикации при

сальмонеллезной инфекции

Сальмонеллезы принадлежат к числу инфекционных заболеваний, весьма

широко распространенных на всех континентах мира. Возбудителем

сальмонеллезов являются микроорганизмы, принадлежащие к роду Salmonella,

семейства кишечных Enterobacteriaceae.

Сальмонеллы – это мелкие бактерии вытянутой формы с

закругленными концами длиной от 1 до 3 и диаметром 0,5-0,8 нм [4].

Сальмонеллез встречается чаще у жителей городов, чем сел, что

связывается с лучшей регистрацией заболеваемости, наличием множественных

детских учреждений, широким употреблением пищевых полуфабрикатов.

Заболевание отмечается круглый год, но максимальное число регистрируется в

теплое время года, что объясняется благоприятными условиями размножения

сальмонелл в пищевых продуктах и реализации инфекции [5].

Таблица 1.1.1.

Статистические данные больных сальмонеллезом г. Пензы.

|Год |Количество |На 100 тыс. |Кол-во больных |На 100 тыс. |

| |больных |населения, % |Пензенской |населения, % |

| |г. Пензы | |области | |

|1996 |187 |34,9 |362 |23,1 |

|1997 |140 |26,1 |316 |20,3 |

|1998 |230 |43,0 |448 |28,8 |

В возникновении сальмонеллеза ведущую роль играют живые бактерии,

гибель которых в организме больного сопровождается развитием

эндотоксинемии. Принято выделять два вида токсичных продуктов

жизнедеятельности микробов-экзотоксии и эндотоксии. К экзотоксинам отнесены

токсичные продукты жизнедеятельности бактерий, активно (при жизни)

секретируемые в окружающую среду, а к эндотоксинам – те ядовитые для

макроорганизма продукты жизнедеятельности, которые освобождаются только при

лизисе микробной клетки [6].

Кроме токсина палочка имеет ряд антигенов клеточной стенки. О-антиген

расположен на поверхности микробной клетки и представляет собой

фосфолипидно-полисахаридный комплекс, включающий 60 % полисахарида, 20-30 %

липида и 3-4,5 % гексозамина. Н-антиген определяется жгутиками.

Поверхностные антигены клеточной стенки провоцируют типоспецифический

антительный ответ, а глубинные – видоспецифический [6,7].

При сальмонеллезе развитие и тяжесть симптомов обусловлены

интоксикацией и обезвоживанием. По мнению А.Ф. Билибина интоксикация –

явление сложное, сводящееся к изменению нервнорефлекторной деятельности и

гуморальной регуляции с обменными сдвигами. К.В. Бунин в основу синдрома

интоксикации ставит воздействие токсина на :

1) падение артериального давления, снижение сократительной способности

миокарда;

2) гормональную регуляцию водно-солевого обмена с изменениями биосинтеза

гормонов в коре надпочечников с угнетением процесса их метаболизма;

3) функцию почек (снижение клубочковой фильтрации, повышение канальцевой

реабсорбции воды, снижение концентрации очищения мочевины) [8].

Сальмонеллезная интоксикация возникает как результат патологии

первичного ответа на инфекционный агент вследствие значительных потерь воды

и электролитов с рвотой и жидким стулом. По мере увеличения дефицита воды и

электролитов на первый план выступают симптомы обезвоживания и поражения

ЦНС. Если процесс прогрессирует, обезвоживание нарастает, появляются

признаки недостаточности кровообращения, которые при интоксикации имеют

клинику шока. Частая рвота и понос – первые признаки интоксикации [9].

Обязательным условием развития заболевания являются наличие большого

количества возбудителей и их токсинов, массовое проникновение антигенов в

кровь. Наибольшей токсичностью отличается липид А, вызывающий следующие

основные реакции: активацию лейкоцитов и макрофагов, стимуляцию выброса

эндогенного пирогена, антогониста глюкокортикоидов, интерферона,

интерлейкинов, подавление тканевого дыхания, активацию системы комплемента,

тромбоцитов, факторов свертывания крови другие [10,11], [рис. 1.1.1].

Главной причиной развития шока при сальмонеллезе считается не

повреждающее действие самих микробов или их токсинов, а своеобразный ответ

организма на них. Под токсико-инфекционным шоком следует понимать

экстремальное состояние организма, наступающее в результате действия

токсичных субстанций возбудителей, патогенных иммунных комплексов на органы

и ткани организма, сопровождающееся острым нарушением метаболизма в них

[12].

Схематическое изображение липополисахаридов

стенок микробов.

Рис. 1.1.1.

С.А. Степанов с помощью аспирационной биопсии обнаружил в тонкой

кишке больных сальмонеллезом изменение эпителия, острое воспаление

слизистой оболочки, нарушение микроциркуляции и сосудистой проницаемости.

К.Х. Ходжаев в эксперименте на крысах показал, что сальмонеллезная инфекция

вызывает нарушение процесов тканевого дыхания и фосфорилирования. Состояние

поджелудочной железы изучено Белянской Т.А. В острый период болезни

отмечено снижение ферментативной активности панкреатического сока – уровень

трипсина был снижен в 71 % случаев, липазы в 55 %, амилазы – в 66 %.

Таким образом эндотоксин вызывает активацию синтеза, преимущественно

протеолитических ферментов, задержку экструзии секретируемых проэнзимов,

что приводит к секреции и поступлению ферментов в лимфатическое и

кровеносное русло [13,14].

При сальмонеллезе развивается обезвоживание, обусловленное потерей

внеклеточной жидкости, а при тяжелом течении заболевания и части клеточной.

Дегидратация в большинстве случаев имеет изотонический характер, сочетаясь

с развитием сгущения крови, дефицитом электролитов, метаболическим ацидозом

в капиллярной и венозной крови [15], [рис. 1.1.2].

2. Молекулярные механизмы развития эндогенной

интоксикации при сальмонеллезе

Явления интоксикации вызывают заболевания, сопровождающиеся

повышенным распадом тканей, усиленными процессами катаболизма,

недостаточностью функции печени и почек, снижением процессов

микроциркуляции [16].

В ответ на действие первичного патогена, которым являются

эндотоксины, сальмонелл, в организме развиваются типовые каскадные реакции,

что лежит в основе современной концепции СЭИ.

На Международном симпозиуме в Санкт-Петербурге (1994 г) было дано

определение этого синдрома как клинического синдрома с проявлением

симптомов интоксикации при патологических состояниях неоднородных по

этиологии и обуславливающих накопление в тканях и биологических жидкостях

организма продуктов патологического обмена веществ, метаболитов,

деструкции клеточных и тканевых структур, разрушения белковых молекул

[17,18].

Шано В.П. с соавторами подчеркивает, что токсическое влияние

липополисахаридной субстанции эндотоксина проявляется комплексом нарушений,

обусловленных повреждением как циркулирующих клеток в кровотоке, так и

эндотелиоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, следствием чего

является выброс в кровоток ряда биологически активных веществ – цитокинов,

интерлейкинов. Главной точкой приложения эндотоксина являются

эндотелиальные клетки, активация их приводит к высвобождению простациклина,

выделению эластазы, токсических метаболитов кислорода, факторов активации

тромбоцитов и комплемента с высвобождением терминального комплекса

комплемента, брадикинина с последующим формированием синдрома повышенной

проницаемости капилляров. Это приводит к тому, что в очаг воспаления

начинают входить компоненты крови, прежде всего фибриноген и тромбоциты.

Фибрин способствует агрегации тромбоцитов, полимеризации фибрина и –

возникновению тромбов. Следствием тромбоза являются нарушения

микроциркуляции с последующей гипоксией, что приводит к дальнейшим

повреждениям клеток в очаге воспаления. Метаболическим результатом этого

является изменение аэробного метаболизма клеток на анаэробный, повышенное

продуцирование лактата и протонов, снижение показателей рН [19].

Среди тканевых (клеточных) медиаторов воспаления важное место

занимают простагландины. Исходными продуктами для биосинтеза

простагландинов являются ненасыщенные жирные кислоты: линолевая,

арахидоновая, пентаноевая. Наибольшее значение имеет в организме

арахидоновая кислота, которая содержится в фосфолипидах клеточных мембран.

Простагландины вызывают сильное диуретическое и натрийуретическое

действие, оказывают разнообразное действие на желудочно-кишечный тракт. Они

могут стимулировать и тормозить сокращение и секреторную активность тонкой

кишки, тормозят секрецию соляной кислоты слизистой оболочки желудка.

Простагландины вызывают секрецию воды и электролитов в просвет кишки,

вызывая диарею, повышают концентрацию ц-АМФ в слизистой оболочке тонкой

кишки, влияют на прочность и упругость эритроцитарной мембраны [20, 21, 22,

49].

3. Показатели уровня эндогенной интоксикации

организма при сальмонеллезе

Анализируя данные литературы за последние десятилетия, можно сказать,

что основными показателями интоксикации при сальмонеллезе являются ПОЛ,

уровня холестерина, ЦИК, ИТ, МСМ и активность каталазы. При развитии

интоксикации на фоне сальмонеллеза происходит активный хемотаксис

нейтрофиллов в очаг воспаления, где они поглощая и переваривая чужеродный

агент, изменяют свою метаболическую активность, характеризующуюся

усилением поглощения кислорода, повышенной утилизацией глюкозы и

гиперпродукцией АФК ([pic]) [23, 24].

Перекисное окисление является универсальным механизмом взаимодействия

кислорода со многими органическими субстратами, в том числе с липидами.

Внедрение кислорода в молекулы окисленного субстрата приводит к образованию

реакционно-способных промежуточных продуктов – свободных радикалов,

гидроперекисей, которые в дальнейшем вызывают повреждение других классов

соединений – белков, нуклеиновых кислот, углеводов (рис. 1.3.1).

Метаболизм супероксидного радикала в норме

и при патологии (Владимиров Ю.Я., 1998)

Рис. 1.3.1.

Накопленные к настоящему времени данные литературы позволяют сделать

вывод о том, что свободнорадикальное окисление липидов при сальмонеллезной

инфекции играет определенную патогенетическую роль [25, 50].

Установлено, что при развитии ПОЛ в биомембранах понижается

содержание легкоокисляемых полиненасыщенных жирных кислот и изменяются

физико-химические свойства: микровязкость, текучесть, мембранный потенциал,

полярность внутренних областей мембран. Таким образом, изменяются

транспортные свойства мембраны и активность ферментов [26].

Регуляция свободнорадикального окисления обеспечивается в клетке

системой антиоксидантной защиты. Так, накапливающаяся в процессе ПОЛ

перекись водорода обезвреживается с помощью каталазы, присутствующей во

всех тканях организма. Каталаза (КФ 1.11.1.6.) представляет собой

гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250000 Д, локализованный

в пероксисомах клеток [27].

Митохондриальная каталаза участвует в оксидазном пути окисления,

сопровождающемся запасанием энергии в виде АТФ. Блокирование транспорта

электронов в дыхательной цепи приводит к стимуляции пероксисомального

окисления. При потологиях, связанных с нарушением энергетических процессов,

каталаза пероксисом может выходить из них и участвовать в окислении на

мембранах эндоплазматического ретикулума [28, 53].

В работе Л.Б. Оконенко с соавторами о состоянии антиоксидантной

системы судили по активности СОД, глутатионпероксидазы и каталазы, анализ

данных выявил дефицит антиоксидантов [29, 30].

При инфекционном токсикозе в мембранах эритроцитов резко снижается

содержание общих фосфолипидов, но увеличивается количество НЭЖК и

лизофосфотидилхолина, что косвенно указывает на повышение активности

фосфолилаз, которые избирательно разрушают липиды мембран. Холестерин

подвергается как активному, так и пассивному обмену в мембранах эритроцитов

[29]. Фермент лецитинхолестеролацил трансфераза превращает эфиры

холестерина в свободный холестерин и тем самым регулирует уровень

свободного холестерина в плазме, что способствует проникновению его в

мембраны. Следовательно, инактивация этого фермента в результате гипоксии

при эндотоксикозе ведет к повышению уровня эфиров холестерина в мембранах

эритроцитов [31,32].

Наряду с уровнем МДА, активности каталазы и уровня холестерина для

диагностики заболевания и его прогноза имеют значение и другие

неспецифические показатели – ЦИК, Ит, МСМ.

Синтезирующиеся при формировании иммунитета специфические антитела

обладают способностью взаимодействовать с антигенами возбудителей и тем

самым вызывать нейтрализацию патогенных микробов и их токсинов. Эта реакция

сопровождается образованием иммунных комплексов антиген – антитело [33, 34,

54, 55]. При патологических состояниях образование ИК выходит из под

контроля, в результате чего развивается та или иная болезнь ИК [рис.

1.3.2.].

Патогенетические механизмы болезней иммунных

комплексов (Сура В.В., 1987)

Рис. 1.3.2.

В результате развития эндотоксемии при сальмонеллезе организм

длительное время контактирует с избытком АГ как экзогенного (компоненты

микробных клеток), так и эндогенного (компоненты разрушенных клеток самого

организма) происхождения. Вместе с тем наблюдается угнетение системы

комплемента, ответственного за лизис микробных клеток. В этих условиях

значительного избытка АГ и недостаточности выработки АТ может привести к

образованию ИК, которые способны откладываться в определенных тканях и

вызывать острые воспалительные реакции. При значительных отложениях

наблюдаются функциональные и морфологические повреждения органов и тканей

[35].

Связываясь с клеточной мембраной ЦИК вызывают выделение в окружающую

среду протеолитических ферментов и основных пептидов. Эти вещества

повреждают протеогликановые компоненты тканей, действуют на базальную

мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].

ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран,

вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к гибели клетки.

В результате появляются различные вещества пентидной природы. Из них

наибольший интерес представляют молекулы средней массы.

Являясь олигопептидами с молекулярной массой 300-5000 Дальтон, они

расцениваются как универсальный критерий эндогенной интоксикации и влияют

на ее уровень и прогноз [37, 38].

МСМ образуются в организме под воздействием повреждающих эндогенных

или экзогенных факторов различного генеза, являются промежуточными

продуктами протеолиза. [39, 57].

Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой

биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют

гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых

кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию,

обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным

свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния

больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].

Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не

только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.

Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный

белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в

плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.

Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его

уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы.

Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их

структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА

обнаруживаются при патологии [41].

О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА,

которая снижается после того, как токсические вещества займут центры

связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных

свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки

зрения как диагностики, так и лечения [42].

2. Материалы и методы исследований

1. Материал исследований

Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных

эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового

диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и

активности каталазы.

Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных

сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа

51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.

Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве

не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов

сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-

20[pic]С.

2. Методы исследований

2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой

(Конюхова В.С., 1989)

Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного

продукта ПОЛ – малонового диальдегида.

Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА

реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с

максимумом поглощения при 535 им.

Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной

воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут,

охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при

6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля,

содержащего вместо плазмы воду.

Расчет: [pic] (мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение

изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.

Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет

[pic]

концентрация МДА = [pic] (мкМоль/л).

2.2.2. Определение активности каталазы

(Королюк М.А., 1988)

Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями

молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки

крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо

сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через

10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски

измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной

пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.

Расчет: [pic] (мкат/л), где

Е – активность каталазы в мкат/л;

А – оптическая плотность холостой и опытной проб;

V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;

t – время инкубации, 600 сек;

К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный [pic].

За единицу активности каталазы принимают то количество фермента,

которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при

заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.

Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.

[pic]

[pic]

[pic] (мкат/л)

2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным

методом «Фотокол»

(Творогова М.Г., 1995)

Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует

холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:

Эфиры холестерина [pic] холестерин + Ж.К.;

Холестерин + О2 [pic] холестинон + Н2О2;

Н2О2 + хромогены [pic] Н2О + окрашенный продукт.

Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта

пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после

проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t =

37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и

инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при

500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно

холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной

температуре.

Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:

[pic] ммоль/л, где

ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.

Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.

2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов

в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)

Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 %

ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.

Реактивы:

1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры

растворить в 1 л дистиллированной воды)

2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.

Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива

№1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл

раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт).

Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На

спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах [pic]

при 450 нм.

Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности,

результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки.

Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic] - количество ЦИК в

100 мл сыворотки.

Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.

Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.

[pic]

[pic]

Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:

[pic] усл. ед.

2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)

Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 %

раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции

света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.

Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В

качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный

дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет

0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25[pic]С. Центрифигируем 3000

об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл

дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете

при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254

нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах,

количественно равных показателям экстинции.

2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация

альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека

флуоресцентным методом

(Миллер Ю.И., 1994).

Принцип метода:

Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных

органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от

условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из

альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от

числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства

молекулы альбумина.

Состав набора:

Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора

используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт

ЭДТА.

Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является

специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции

которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного

альбумина.

Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с

сывороткой позволяет определить ОКА.

Определение показателя ЭКА:

К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2.

Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны

возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.

Определение показателя ОКА:

В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить

интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в

интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.

Подготовка образцов крови к измерениям:

Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл

дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в

пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут

жидкость 2,0 мл полученного образца.

Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.

3. Результаты исследования и их обсуждение

1. Определение показателей уровня интоксикации

в сыворотке крови практически здоровых людей

Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА,