Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК

СОКРАЩЕНИЙ..................................................................

............................3

ВВЕДЕНИЕ....................................................................

.........................................................4

ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................

....................................5

СТРОЕНИЕ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ............................................................

.......................5

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ

ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У

МЛЕКОПИТАЮЩИХ...............................................................

.....7

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ

ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ

ПОЗВОНОЧНЫХ......................................................11

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ

ИГ..........................................................................

.............19

МАТЕРИАЛЫ И

МЕТОДЫ......................................................................

.....................24

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ДНК.........................................................................

...................................24

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ

ГЕЛЯ........................................................................

.........................24

ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ

ЗОНДОВ......................................................................

25

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ

ДНК.........................................................................

.............26

ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ

CsCl........................................26

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ

КЛЕТОК...................................................27

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ

РЫБ.................................................................28

ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ

ЛЕЙКОЦИТОВ.....................................................28

ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК

ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ

КЛЕТОК......................................................................

...............28

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ

кДНК......................................................................29

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ

РЕАКЦИЯ.....................................................................

..........33

СУБКЛОНИРОВАНИЕ

ДНК.........................................................................

..........................34

СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ

кДНК........................................................................

................34

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

ДНК.............................35

САУЗЕРН БЛОТ

ГИБРИДИЗАЦИЯ................................................................

.....................36

РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................

...................................................38

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ

СКРИНИНГ.....................................38

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ

СТРУКТУРЫ...................................................................

...40

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ

СТРУКТУРЫ..............................................40

АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ

ОРГАНИЗАЦИИ.................................................................

.............41

ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................

..................................................46

ВЫВОДЫ......................................................................

.........................................................48

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................

..............................49

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИГ

иммуноглобулины

пн

пар нуклеотидов

тпн тысяч

пар нуклеотидов

е.а.

единица активности

ИПТГ

изопропилтиогалактозид

ТЕМЕД N,N,N,'N'-тетраметил-этилен-

диамин

трис

трис(гидроксиметил)аминометан

дНTФ

дезоксиаденозинтрифосфат

ддНТФ

дидезоксинеклеотидтрифосфат

дНТФ

дезоксинуклеотидтрифосфат

рATФ

рибоаденозинтрифосфат

ДТТ

дитиотрейтол

Na2ЭДТА этилендиаминтетраацетат

натрия

SDS

додецилсульфат натрия

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-

галактозид

ВВЕДЕНИЕ

В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих

лежит сложный комплекс молекулярно-генетических и физиологических

механизмов, обеспечивающих реорганизацию, мутагенез и клональную экспрессию

генов иммуноглобулинов. Возникновение этой подсистемы иммунитета связывают

с появлением хрящевых рыб.

На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде

повторяющихся кластеров V-J-C генных сегментов. При подобной организации

разнообразие продуцируемых антител основывалось, прежде всего, на

количестве имевшихся в геноме кластеров, каждый из которых кодировал один

вариант полипептидных субъединиц ИГ. В ходе дальнейшей эволюции произошел

переход от кластерной к сегментарной организации, обеспечивающей

дополнительный источник разнообразия за счет комбинативной рекомбинации

генных сегментов. Предполагается, что этот переход также имел важное

значение для регуляции экспрессии генов и осуществления механизмов

клонального отбора антителопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответа.

Настоящая работа представляет собой часть проекта, направленного на

изучение эволюции механизмов изотипического исключения генов легких цепей

ИГ у низших позвоночных. Целями работы являлись изучение структуры и

организации генов легких цепей ИГ стерляди (Acipenser ruthenus),

представителя филогенетически древней группы костно-хрящевых рыб.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Иммуноглобулины выполняют в организме позвоночных функцию гуморальных

антител и антиген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов. Особенностью этого

класса белков является огромное разнообразие, позволяющее им вступать во

взаимодействие с фактически любыми биологическими макромолекулами.

Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух

идентичных легких (L) полипептидных цепей. H- и L-цепи построены из

нескольких доменов, каждый из которых состоит примерно из 110

аминокислотных остатков. У млекопитающих существует пять классов H-цепей:

(, m, (, (, и (. Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нескольких

(трех или четырех) C-концевых доменов. N-концевые домены различаются в

разных молекулах и называются вариабельными (V) доменами. C-концевые домены

имеют одинаковую структуру у молекул одного класса и называются

константными (С) доменами (рис. 1) (Пол, 1987).

Среди L-цепей млекопитающих различают два типа: лямбда и каппа.

Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного и одного константного

доменов. В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-цепи

(Roitt et al., 1993).

Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем, что V и C

области кодируются разными генами (генными сегментами), физически

разнесенными в зародышевой ДНК.

В формировании вариабельных доменов H-цепей участвуют три генных сегмента:

вариабельный (V), D-сегмент (от англ. diversity- разнообразие) и J-сегмент

(от англ. joining- соединяющий). С-области Н-цепей разных классов

кодируются отдельными генами (Roitt et al., 1993).

Рис. 1. Схема строения молекулы иммуноглобулина.

Типичная молекула иммуноглобулина содержит две идентичные легкие (L)

и две идентичные тяжелые (H) цепи, связанные между собой ковалентно

дисульфидными связями. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного (VL) и

одного константного (СL) домена. Н-цепь состоит из одного VH и нескольких

CН доменов.

В формировании зрелого гена L-цепи участвуют три генных сегмента: V-

сегмент и J-сегмент кодируют V-домен, C-сегмент кодирует константный домен.

На поздних стадиях развития В-лимфоцита генные сегменты, кодирующие

вариабельные домены, объединяются в различных сочетаниях, образуя матрицу

для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Различные виды млекопитающих имеют сходную схему организации и

экспрессии генов ИГ. Одним из наиболее изученных в этом отношении видов

является человек. Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируются генами,

расположеными в разных локусах и на разных хромосомах. Каппа локус состоит

из большого количества V( генных сегментов, собраных в группы, пяти J( и

одного С( сегмента.. Такой тип организации называется сегментарным (рис.

2). Лямбда локус состоит из группы V( сегментов, точное количество которых

неизвестно, и семи пар J(-C( сегментов. Три из них (JC(4 - JC(6) являются

псевдогенами (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).

В процессе развития В-лимфоцита в кроветворных органах один из V

сегментов соединяется с одним из J сегментов посредством сайтспецифической

рекомбинации (Schatz et al., 1992). В этот процесс вовлекаются специальные

олигомерные последовательности: гепта- и нонамеры, фланкирующие с 3'

стороны V сегмент и с 5' стороны J сегмент (рис. 3) (Aguilera et al., 1987;

Hesse et al., 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов

является конфигурация промежутков между гепта- и нонамерами, называемых

спейсерами. С V и J генными сегментами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12

пн спейсеры соответственно, а с V и J сегментами каппа типа - 12 пн и 23 пн

спейсеры (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).

л

Рис. 2. Схема строения лямбда и каппа локусов генов L-цепей ИГ

человека.

Лямбда локус содержит много V( сегментов и семь пар

близкорасположенных J(-C(. Три из них яляюся псевдогенами ((). Каппа локус

содержит много V( пять J( и один C( генный сегмент (Hieter et al., 1981;

Roitt et al., 1993).

Обозначения: - сигнальные олигомеры.

Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей,

задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе

млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны VL сегмент и

с 5’ стороны JL сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из

VL сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из JL сегмента.

Это делает возможным соединение VL и JL сегментов без нарушения рамки

трансляции (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).

Обозначения: - сигнальные олигомеры.

Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго

упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа

типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной,

тоесть не привела к появлению полноценного гена, то рекомбинация происходит

в каппа локусе на гомологичной хромосоме. В случае повторной абортивной

перестройки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах. Если в

клетке непродуктивно перестроились все четыре локуса, то она превращатся в

0-клетку и подвергается апоптозу. Если же перестройка одного из локусов

привела к образованию функционального гена, то рекомбинация остальных

локусов блокируется. Детали механизма блокирования неизвестны, однако

установлено, что необходимым условием для него является транскрипция

продуктивно перестроенного гена. В результате в каждом индивидуальном

лимфоците синтезируется только один тип L-цепей, каппа или лямбда, и

экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом.

Эти феномены, называемые изотипическим и аллельным исключениями лежат в

основе ключевого принципа функционирования иммунной системы - принципа

клональной селекции (Пол, 1987; Strob, 1987).

В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов

вариантов антител, хотя в геноме содержится значительно меньшее количество

генных сегментов, которые могут участвовать в формировании вариабельных

доменов. В случае L-цепей, основным источником разнообразия является

комбинативное сочетание V и J сегментов. Дополнительным источником является

смещение рекомбинационной рамки в месте их соединения. Кроме того, V генные

сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной

конверсии. Очень существенный вклад в разнообразие специфичностей антител

вносит соматическое мутирование вариабельных генных сегментов в сайтах,

участвующих в формировании антигенсвязывающего центра. Соматическое

разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе путем включения

гипермутационного механизма в клетках памяти в зародышевых центрах

лимфатических узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993).

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ

ПОЗВОНОЧНЫХ

Хрящевые рыбы.

Гуморальный иммунный ответ в виде специфических антител

обнаруживается только у позвоночных. Наиболее примитивными видами, у

которых обнаружена способность синтезировать ИГ, являются хрящевые рыбы.

Представители трех основных таксонов (акулы, скаты и химеры) продуцируют

антитела в ответ на введение широкого спектра антигенов. Однако, в отличие

от млекопитающих, гетерогенность сывороточных антител у хрящевых рыб

выражена очень слабо. Кроме того, у них не обнаружено созревание иммунного

ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется

(Flajnik, 1996). Результаты исследований последних лет продемонстрировали,

что организация генов ИГ у хрящевых рыб также имеет ярко выраженные

особенности.

У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей, локализующиеся в

разных локусах. В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры,

имеющие по одному V, J и C генному сегменту (рис. 4). Таких кластеров

содержится несколько десятков или даже сотен в одном локусе на расстоянии

12-15 тпн друг от друга (Rast et al., 1994).

Гены первого типа найдены у разнозубой акулы (Heterodontus francisci)

(Shamblott and Litman, 1989) и малого ската (Raja erinacea) (Anderson et

al., 1995). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн. V и J, J и C генные

сегменты разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. У ската V и J

сегменты слиты в зародышевой ДНК.

Гены второго типа обнаружены у пятнистой химеры (Hydrolagus colliei)

(Maisey, 1984), песчаной акулы (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al.,

1992; Hohman et al., 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех

изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже

в зародышевом геноме. V и C гeнные сегменты разделены 2-3 тпн.

Рис. 4. Схема строения локусов генов L-цепей ИГ у акулы.

Организация генов у акулы имеет кластерный тип. Каждый кластер имеет

размер 3 - 6 тпн и содержит по одному VL, JL и CL генному сегменту.

Обнаружено три типа генов L-цепей ИГ. Локусы генов первого и третьего

типов имеют схожую организацию. В этом случае VL и JL, JL и CL сегменты

разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно (А) (Rast et al., 1994).

В локусе генов второго типа VL и JL сегменты соединены уже в

зародышевом геноме (Б).

Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки (Gynglimostoma

cirratum) (Greenberg et al., 1993) и разнозубой акулы (Rast et al., 1994).

В кластерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены, как и в

кластерах первого типа, примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. V и J генные

сегменты фланкируются сайтами специфической рекомбинации со спейсерами 12 и

23 пн, что соответствует конфигурации спейсеров в локусах каппа типа

млекопитающих. По первичной структуре гены третьего типа тоже наиболее

близки к генам каппа типа высших позвоночных (гомология по аминокислотной

последовательности составляет около 60%).

Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии:40-

50% по нуклеотидной последовательности С сегментов и 50-60% по

последовательности V сегментов (Hohman et al., 1993).

Полученные данные показывают, что у хрящевых рыб имеется очень

большое количество генных сегментов. Однако специфика организации генов

исключает комбинативное сочетание сегментов. Все разнообразие антител у

хрящевых рыб формируется только за счет экспрессии большого количества

кластеров.

Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили

низкую гетерогенность генов (85-95%), что указывает на отсутствие

соматического мутагенеза (Rast et al., 1994).

Костистые рыбы.

Анализ сывороточных антител пещерного сомика (Ictalurus punctatus)

показал наличие трех типов L-цепей с различными молекулярными массами: 26,

24 и 22 кДа. Два вида антител мыши, 3F12 и 1G7, захватывают более 90% от

общего количества иммуноглобулинов в реакции иммунопреципитации. При этом

3F12 антитела связываются с молекулами, содержащими L-цепи массой 24 и 22

кДа, а 1G3 антитела с другой субпопуляцией, содержащей L-цепи массой 26

кДа. На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса, называемые F и G

(Lobb et al.,1984).

Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип (рис.

5). В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и два V сегмена.

Вариабельные генные сегменты расположены всегда в противоположной

транскрипционной полярности к J и C сегментам . В ряде геномных клонов один

V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента. Размер кластера

равен примерно 3 тпн, расстояние между кластерами около 6 тпн (Ghaffari and

Lobb, 1993; Bengten, 1994).

Хотя гены L-цепей сомика имеют низкую гомологию с генами других

позвоночных (40-50% по нуклеотидной последовательности), их можно отнести к

каппа типу высших позвоночных, так как сходство по первичной структуре с

лямбда типом ниже. Кроме того, конфигурация спейсеров имеет характер каппа

типа: 12 пн спейсер ассоциирован с V, 23 пн спейсер с J сегментом (Ghaffari

and Lobb, 1993).

У радужной форели (Oncorhynchus mykiss), представителя другого

семейства костистых рыб, также обнаружены два типа L цепей (Daggfeldt et

al., 1993). Один из них (L1) высокогомологичен G типу сомика по структуре V

и C областей и соответствующий локус имеет сходную организацию.

По-видимому, у этих видов объединение V и J сегментов происходит

только за счет инверсий с восстановлением единой полярности транскрипции.

Разнообразие вариабельных доменов образуется в результате комбинативного

сочетания V и J сегментов в пределах одного кластера. Не исключается, что в

перестройки могут вовлекаться и соседние кластеры.

Интересной особенностью костистых рыб является очень высокая

пропорция мРНК, представляющей так называемые стерильные транскрипты

(Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскрипты включают в себя только С-

сегменты и фланкирующие их 5’и 3’-нетранслируемые участки. Количество

стерильных транскриптов у сомика и форели в 5 раз превышает количество

полных VJC-транскриптов.

Рис. 5. Геномная организация локуса генов L-цепей ИГ у пещерного

сомика.

Генные сегменты организованы в кластеры. Каждый кластер содержит два

VL и по одному JL и CL сегменту и имеет размер около 5 тпн. Расстояние

между JL и CL около 1000 пн, VL сегменты удалены от 5' конца JL сегмента на

3 тпн. VL сегменты всегда расположены в противоположной транскрипционной

полярности по отношению JL и CL сегментам (Ghaffari and Lobb, 1993).

Амфибии.

У шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) выявлено три семейства генов L-

цепей ИГ, кодирующих три различных изотипа: L1 (ро), L2 (сигма) и L3 (рис.

6).

Все три локуса имеют сегментарный характер организации. L1 локус

содержит множественные VL1 сегменты, разделенные в геноме 2.1 - 3.6 тпн,

пять JL1 сегментов, три из которых идентичны, и один CL1 генный сегмент

(Stewart et al., 1993). JL1 и VL1 сегменты фланкируются каноническими гепта-

и нонамерными сигнальными последовательностями, разделенными 12 пн у VL1 и

23 пн у JL1 сегментов (Sakano et al., 1980).

Локус генов второго типа разделяется на два семейства, (1 и (2,

которые в геноме располагаются отдельно. Геном лягушки содержит

множественные V(1 и несколько V(2 геных сегментов, одну пару J(1-C(1 и пару

J(2-C(2 (Schwager et al., 1991). Расположение генов этого типа друг

относительно друга точно не определено.

Недавно был обнаружен третий тип генов L-цепей у лягушки. В геноме

лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа. Общее количество

VL3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий. Каждый VL3 элемент может

рекомбинировать с одной из двух пар JCL3 генных сегментов (Haire et al.,

1996).

Гены трех типов значительно различаются: гомология на аминокислотном

уровне составляет приблизительно 30% (Zezza et al., 1991). В то же время,

ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами

млекопитающих.

Семейство генов первого типа можно отнести к каппа типу по нескольким

причинам (Zezza et al., 1992): а) высокая гомология первичной структуры

(более 50%); б) существенное сходство геномной организации локуса (много

VL1 и один CL1 генный сегмент); в) кофигурация спейсеров между гепта- и

нонамерыми соответствует каппа типу; г) JL1 и CL1 генные сегменты разделены

примерно 3.5 тпн, что приблизительно равно расстоянию между JL( и CL(

элементами человека (Sakano et al., 1979; Hieter et al., 1982) и

значительно больше чем расстояние между JL( и CL( млекопитающих (Blomberg

et al., 1982; Udey, 1987).

Рис. 6. Геномная организация локуса первого и третьего типов генов L-

цепей ИГ у шпорцевой лягушки.

Локус семейства L1 содержит множественные VL1 сегменты, пять JL1

сегментов один CL1 генный сегмент. Расстояние между VL1 равно 2.1 - 3.6

тпн. Локус семейства L3 имеет около 30 VL3 сегментов, располагающихся

группами, JL3 и CL3 сегменты располагаются парами: JCL31 и JCL32 (Stewart

et al., 1993; Haire et al., 1996).

Третий тип генов L-цепей лягушки более близок к лямбда типу

млекопитающих: а) более высокая гомология с генами лямбда типа

млекопитающих (около 50% с (- и 30-40% с (-типом по аминокислотной

последовательности); б) JL3 и CL3 генные сементы экспрессируются всегда

парами JL31-CL31 и JL32-CL32, что напоминает ситуацию в лямбда локусе

человека и мыши (Haire et al., 1996).

Гены второго типа L-цепей лягушки незначительное и приблизительно

одинаковое сходство с генами каппа и лямбда типов млекопитающих (30-40% и

25-40% по нуклеотидной последовательности, соответствено) (Schwager et al.,

1991).

Генетическое разнообразие у лягушки достаточно велико и сравнимо с

разнообразием генов у млекопитающих. Однако репертуар антительных

специфичностей в сыворотке крови значительно уступает репертуару высших

позвоночных (Hsu et al., 1991). Этот парадокс можно объяснить наличием

механизма соматической селекции клонов В-лимфоцитов, который элиминирует

клетки, несущие антитела, специфичные к собственным антигенам организма, а

также те клетки, которые продуцируют несколько типов антител (Wilson et

al., 1992).

Основной вклад в формирование разнообразия L-цепей антител у лягушки

дают первое и третье семейства генов, имеющие высокий комбинативный

потенциал и большое разнообразие зародышевых V генных (Haire et al., 1996).

Второе семейство имеет несколько слабо отличающихся друг от друга VL2

элементов и не играет существенной роли в формировании разнообразия

(Stewart et al., 1993). Таким образом, разнообразие генов L-цепей у лягушки

а создается посредством: а) комбинативного соединения V и J генных

сегментов; б) смещения рекомбинационной рамки при соединении V и J

сегментов. Нельзя исключить, что определенный вклад в разнообразие может

вносить соматический мутагенез. Во всяком случае, наличие этого механизма

показано для генов H-цепей лягушки (Zezza et al., 1992).

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ

Согласно наиболее популярной в настоящий момент гипотезе гены ИГ и Т-

клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена, кодировавшего

один домен путем различных вариантов последовательных дупликаций (рис. 7).

В эволюции генов ИГ можно выделить три основных события.

1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и

возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической

рекомбинации. Предпологается, что это событие связано с внедрением

транспозона в предковый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных

рецепторов у предков хрящевых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и

скатов слитых VJ генов в локусах L-цепей классов I и II, является, по-

видимому, вторичным событием и, возможно, обусловлено фиксацией генов,

кодирующих антитела строго определенной специфичности (Anderson et al.,

1995).

2. Возникновение механизмов соматического мутагенеза генов ИГ. У

млекопитающих соматический мутагенез обеспечивает как минимум половину

разнообразия антител, являясь основой аффинного созревания антител при

вторичном иммунном ответе (Пол, 1987). Достаточно выражен соматический

мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987).

Ряд данных позволяет предполагать, что соматический мутагенез может

осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий, но эти результаты нуждаются в

более тщательном изучении. В частности, у хрящевых рыб получение

достоверных свидетельств затруднено наличием множественых кластеров генов,

что не позволяет надежно соотносить данные по геномной структуре и

структуре кДНК (Litman et al., 1993).

3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов.

Сегментарная организация может иметь несколько преимуществ. Во-первых,

увеличивается разнообразие продуцируемых антител за счет дополнительных

возможностей комбинирования разных V и J сегментов. Во-вторых, уменьшается

размер локуса за счет

Рис. 7. Гипотетическая схема эволюции структурной организации локусов

генов L-цепей ИГ позвоночных. (Anderson et al., 1995; Gilbert, 1990).

Обозначения: - сигнальные олигомеры, фланкирующие V и J сегменты.

резкого сокращения количества C генов. В-третьих, подобная организация

позволяет упростить регуляцию экспрессии различных локусов.

Ключевым принципом функционирования иммунной системы является принцип

клональной селекции иммунокомпетентных клеток, несущих рецептор

определенной специфичности. Ряд косвенных данных позволяет считать, что у

акул гуморальный иммунный ответ клонально ограничен (Shankey and Clem,

1980). Однако неизвестно, каким образом и насколько эффективно

осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип

“одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изотипическому и

аллельному исключению. При сегментарной организации генов продуктивная

перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других

локусов и, тем самым к их инактивации. Однако, в случае наличия

множественных VJC кластеров, в части из которых VJ сегменты слиты в

зародышевой ДНК, механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более

сложными или не столь эффективными. Таким образом, переход от кластерной к

сегментарной форме организации генов ИГ мог иметь принципиальное значение

для формирования полноценной системы гуморального иммунитета.

Вопрос о том, на каком этапе филогенеза произошел этот переход

остается открытым. Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы

сегментарно. При этом, в случае L-цепей наблюдается два основных типа

организации: каппа-подобный (один С ген, семейство J сегментов и семейство

V сегментов) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов).

По всей видимости, различные типы L-цепей амфибий произошли от различных

типов L-цепей хрящевых рыб, однако относительно невысокая гомология по

первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью

(Gilbert, 1990).

У сомика и радужной форели, представителей костистых рыб, организация

генов L-цепей и Н-цепей отличается. Гены Н-цепей костистых рыб организованы

подобно млекопитающим сегментарно (Bengten et al., 1991). Организация генов

L-цепей имеет кластерный характер. В то же время, в отличие от хрящевых

рыб, транскрипционная ориентация V генов у них изменена.

Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно

специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно (Рис.

8). Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут

представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).

В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и

организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые

являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше

настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения

относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих

(предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И., 1941),

очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили

черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием

могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и

амфибиями.

Рис. 8. Эволюционное древо низших позвоночных ( по Северцеву А. Н.,

1939).

Обозначения: - таксоны, имеющие ныне живущих представителей, -

таксоны, существование которых доказано палеонтологическими исследованиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК

В агарозном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере

ТАЕ, имеющем состав: 0.04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др.,

1984).

В полиакриламидном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0,5-кратном

буфере ТБЕ, имеющем состав: 0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 2

мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10%

раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др., 1984).

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ

Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.

Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой

ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на

диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК

(2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы

проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем

состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др., 1984).

Адсорбция на кремниевой пудре.

Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали

участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М

раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой

пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300

мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После

этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и

дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ

трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с

силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).

Замораживание - оттаивание.

Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали

центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к

супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при

12000 g в течение 10 мин.

ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ

500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при

100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-

кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2 и 1,0 мМ 2-

меркаптоэтанол), 0,1-0,5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других

немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили

водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12

е.а.) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку

зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10

(Маниатис и др., 1984).

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Клетки Escherichia coli, выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl,

1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7,5) (среда LB) с

ампициллином (50 мкг/мл), осаждали центрифугированием при 4000 g. Затем

осадок суспендировали в буфере STET (8% сахароза, 0,5% тритон X-100, 10 мМ

трис-HCl и 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8,0) и добавляли лизоцим до концентрации 0,8

г/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и при

100оС в течение 1 мин. После этого клеточный дебрис осаждали

центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин.

Для осаждения плазмидной ДНК к супернатанту добавляли 1/10 объема 3 М

раствора ацетата натрия, равный объем изопропанола и центрифугировали при

16000 g в течение 15 мин при 20оС. Затем промывали осадок добавлением 80%

этанола и повторным центрифугированием в течение 5 мин при 20оС (Маниатис и

др., 1984).

ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В

ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl

На каждые 10 мл раствора плазмидной ДНК, полученного после осаждения

лизированных клеток (см. Выделение плазмидной ДНК), добавляли 1 г сухого

CsCl, соль растворяли, после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0,8 мл

раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Смесь помещали в

центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и

бромистого этидия той же плотности и центрифугировали в роторе Ti 60 при

45000 об/мин и температуре 20оС в течение 36 часов. После этого отбирали

кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый

этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола,

предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl.

ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, добавив равный объем 1 М

раствора NH4Cl и два объема этанола. После промывания этанолом осадок ДНК

растворяли в воде до концентрации 1 мкг/мкл (Маниатис и др., 1984).

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Химическая трансформация.

Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' и

выращивали в 100 мл 2-кратной среды Луриа (2% бакто-триптон, 1% бакто-

дрожжевой экстракт, 0,1% NaCl, 0,4% глюкоза, рН 7,0) при 37оС до оптической

плотности D550=0,35. Клеточную суспензию выдерживали при 0оС в течение 2

часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4оС

и суспендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl2, 70 мМ MnCl2, 40

мМ NaAc, рН 5,5). После этого суспензию клеток выдерживали при 0оС в

течение 30 мин, после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А

с 15% глицерина.

Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли

30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в

течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего

добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали

центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др., 1988).