Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

Губкин, А. И. Коган, 1971; J.E. Butler, C. Maxwele, 1972; P. Blackmer,

1973; D. M. Barber, 1978; D. M. Barber, 1979; J. J. Geene, 1984 В. Б.

Билоштан, 1985; С. В. Вальциферова, 1997].

Из молока были получены иммунные лактоглобулины против сальмонелл,

бруцелл, вируса ящура и полиомиелита [P. Lepine, 1963]. Эти препараты

оказались пригодными для применения с лечебной и профилактической целью не

только для телят, а и для обезьян. Автор приводит данные, подтверждающие

преимущества применения лактоглобулинов по сравнению с цельными иммунными

сыворотками молозива и крови.

Болгарские исследователи [К. Геров, П. Чушков, Р. Георгиева, 1965]

изготовили из молозива препарат, который назвали лактоплазмин. По мнению

авторов лактоплазмин содержит лактоглобулины, иммунные тела, витамины,

микроэлементы и, являясь биологически ценным продуктом, может быть

использован самостоятельно или в комбинации с другими средствами при

заразных и незаразных болезнях молодняка, при которых понижается общая

резистентность организма. Этот препарат является эффективным средством

профилактики и лечения различных видов расстройств пищеварения у телят.

В ветеринарно-бактериологическом институте Бернского университета

(директор профессор H. Fey) и научно-исследовательской лаборатории Бернской

ветеринарной школы (заведующий Graub) из иммунного молозива изготовлен

гамма-глобулиновый препарат (ГГП) или гамалин по Граубу [H. Fey, 1972].

Давая обзор работам, проведенным в этих учреждениях и анализируя

литературу по методам получения и результатам изучения свойств ГГП, [K.

Walser und H. Brumer, 1987] отмечают высокую терапевтическую и

профилактическую эффективность применения этого препарата при инфекционных

заболеваниях сельскохозяйственных животных. Они полагают, что наиболее

результативным будет применение препарата при колиинфекциях и

энтеротоксемиях.

Из молозива коров, иммунизированных внутривыменно против паратифа А. Ф.

Барабаш, 1966, выделил путем осаждения сернокислым аммонием специфический

противопаратифозный лактоглобулин. Полученный препарат применялся

парентерально и показал выраженные профилактические и лечебные свойства на

лабораторных животных и телятах.

Из молока коров, вакцинированных внутривыменно ящурным антигеном

изготовили иммунолактон против вируса типа А, а затем изготовили

бивалентный иммунолактон против вируса типа А и О [В. П. Онуфриев, В. К.

Журавлёв, К. В. Чунаев, А. И. Дудников, Ю. Ф. Швецов, Б. П. Мартьянов,

1967]. Введение иммунолактона лабораторным животным, поросятам и телятам в

дозе 0,5-1,5 мг на кг массы тела предохраняло животных от заболевания

ящуром. Авторы указывают, что от одной коровы со средней продуктивностью 10

л молока в сутки в течение месяца можно изготовить иммунолактон в

количестве, которое предохранит от ящура 300 телят или 800 поросят.

Иммунизируя стельных коров вначале подкожно концентрированным

адсорбированным столбнячным анатоксином, а затем и внутривыменно нативным

столбнячным анатоксином, получили сыворотку молозива с наличием

противостолбнячных антитоксинов 850-2000 АЕ/мл, из которой выделили

лактоглобулин, обладающий выраженными профилактическими и лечебными

свойствами в опытах на белых мышах, крысах, ягнятах, поросятах и жеребятах

[B. C. Барабаш, 1968].

Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно пуллорным

антигеном, путем осаждения сернокислым аммонием получен специфический

лактоглобулин, обладающий профилактическими свойствами в опытах на белых

мышах и на цыплятах 10-30-дневного возраста [М. Г. Кондратюк, 1970].

Из сывороток молозива коров, гипериммунизированных паратифозной вакциной

и бруцеллезным антигеном для РА, путем высаливания сернокислым аммонием при

20 % насыщении, выделен специфический паратифозный и бруцеллезный

лактоглобулин, из которого изготовили люминисцируюшие лактоглобулины для

диагностики паратифа телят и экспресс-индикации бруцелл [В. А. Атамась,

1968; В. А. Атамась, 1969].

Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно против

диплококковой септицемии, получен специфический лактоглобулин и испытан с

профилактической и лечебной целью в опытах на телятах. Противодиплококковый

лактоглобулин обладал довольно выраженными профилактическими и лечебными

свойствами [В. В. Май, 1970].

В ФРГ широко применяют гамма-глобулиновые препараты для профилактики и

лечения колибактериоза и налажено промышленное производство гамма-

глобулиновых препаратов из сыворотки убойных животных, сыворотки

иммунизированных животных и молозива [R. Kruedener, 1970].

Из молока коров, гипериммунизированных внутривыменно модифицированным

штаммом БУК вируса болезни Ауески получен иммунолактон против болезни

Ауески [Д. Ф. Осидзе, В. К. Муравьев, В. Т. Ночевный, В. П. Онуфриев, В. М.

Кравченко, 1972]. Авторы на основании проведенных исследований, установили

принципиальную возможность диателической иммунизации коров штаммом БУК

вируса болезни Ауески с целью получения специфической лактосыворотки и

иммунолактона. Препарат в дозе 0,5-2,0 г/кг массы тела животного обладал

выраженным профилактическим действием. Пассивный иммунитет у животных

сохранялся 21 день. Лечебный эффект отмечали только после применения

иммунолактона в первые двое суток после инфицирования животных.

Путем осаждения сернокислым аммонием молозивной сыворотки, был получен

специфический лактоглобулин который обладал профилактическими и лечебными

свойствами при экспериментальном и спонтанном заражении телят

колибактериозом [Н. С. Жосан, 1974; Н. С. Жосан, 1976].

Для получения лактоглобулина [Е. В. Гублер, А. А. Генкин, 1978]

использовали молозиво первого и второго удоев после отела коров. Молозиво

подогревали до температуры 38-40° С, затем к нему добавляли

свежеприготовленный раствор пепсина из расчета 100 мл на 900 мл молозива.

После отделения молозивной сыворотки ее фильтровали через 4-5 слоев марли,

затем через бумажный фильтр и консервировали 5 %-ным раствором фенола в 0,5

%-ном отношении к ее объему. Добавляли его при постоянном помешивании из

расчета 11,1 мл на 100 мл препарата. Выпаивали лактоглобулин телятам в

подогретом виде (38° С) в дозе 100-120 мл, первый раз за 30 мин до

кормления молозивом, второй к концу первых суток. Больным животным после

голодной диеты (8-9 ч) его давали утром до кормления один раз в сутки 2-3

дня в такой же дозе.

Из сыворотки крови отелившихся коров, находившихся в родильном отделении

не менее 10 дней В. П. Павлов, Т. Н. Грязнева, Е. В. Чичикова, 1988,

изготовили гаммаглобулин. Кровь брали у клинически здоровых животных (до 2

л от каждого). Из сыворотки крови готовили гаммаглобулин, используя 3 %-ный

раствор этакридина лактата. Новорожденным телятам через каждые 3 дня

инъецировали специфический гаммаглобулин внутримышечно в дозе 1 мл/кг массы

тела, декстрофан и тривит в дозах соответственно 5 мл и 2 мл внутримышечно,

а также в течение трех суток 2 раза в день внутримышечно вводили гентамицин

в дозе 1,5 мг/кг массы, что позволило профилактировать желудочно-кишечные

болезни у 100 % животных.

Для коррекции иммунодефицита неонатальных телят использовали

колостральную сыворотку и лактоглобулин. [Н. С. Жосан, 1992]. Препараты

вводили внутримышечно или подкожно, в дозе по 0,5 мл на кг живой массы

дважды с интервалом 24 ч. Данные препараты повышали естественную

резистентность организма, содержали неспецифические антитела против

энтеропатогенов циркулирующих, в каждом конкретном хозяйстве при условии

изготовления колостральной сыворотки и лактоглобулина, из молозива,

полученного от коров данного хозяйства.

Применение молозива и его производных (молозивный иммуногормональный

препарат, молозивная сыворотка, гидролизат казеина) снижает заболеваемость

телят диареей на 50-60%, при этом болезнь протекает в легкой форме со 100%

выздоровлением. Парентеральное введение этих препаратов новорожденным

телятам способствует повышению уровня белка в сыворотке крови в 1,5 раза,

иммуноглобулинов в 2 раза, уровень лейкоцивот у этих животных не превышал

8000, бактериальная загрязненность фекалий была в 2-3 раза ниже, чем у

телят, которым молозиво давали только внутрь. Максимальный лечебно-

профилактический эффект молозивная терапия дает в том хозяйстве, где

молозиво было получено [В. В. Бурсуков, 1993; С. В. Вальциферова, 1997].

Исходя из литературных данных, следует отметить, что иммунное молозиво,

молоко и полученные из них препараты обладают выраженными профилактическими

лечебными свойствами.

Сравнительная дешевизна сырья, используемого для получения препаратов из

молозива (практически оно не используется в хозяйствах) [М. Х. Шайхаманов,

В. П. Грамолин, Б. М. Авакаянц, 1993], простота изготовления, высокая

эффективность послужит основанием для получения указанных препаратов в

производственных условиях.

заключение

Анализируя данные литературы, касающиеся состояния естественной

резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при

колибактериозе, необходимо выделить следующие основные моменты:

. колибактериоз занимает среди заболеваний новорожденных животных

одно из ведущих мест и наносит значительный экономический ущерб;

. высокий уровень резистентности обеспечивает широкий диапазон

ответных реакций организма на влияние различных факторов внешней

среды в том числе и микроорганизмов, позволяющих ему

адаптироваться на уровне физиологической реактивности;

. животные с низким уровнем неспецифической резистентности не

способны адаптироваться к изменившимся условиям внешней среды,

что часто вызывает истощение резервной защитно-приспособительной

реактивности и, как следствие этого, приводит к гибели животных;

. сущность защитных факторов против колибактериоза телят

ассоциируется с лактоглобулиновой фракцией и уровнем К-антител-

агглютининов в сыворотке молозива коров и в сыворотке крови

новорожденных телят;

. фагоцитирующие лейкоциты, лизоцим, комплемент, пропердин и

иммуноглобулины обладают функцией антител, противомикробное

действие которых в совокупности выражается бактерицидной

активностью сыворотки крови;

. уровень иммуноглобулинов является одним из важных показателей

резистентности организма новорожденного. При этом следует

определять и учитывать иммунный статус до первой выпойки молозива

и после его скармливания;

. абсорбция колостральных иммуноглобулинов находится в прямой

зависимости от ряда факторов важнейшими из которых являются:

способность новорожденных телят усваивать их из молозива, условия

внешней среды, качество молозива и своевременная выпойка первого

молозива в адекватном количестве;

. лактоглобулин совместно с ретинолом отличаются высоким иммуно-

корректирующим эффектом и широтой профилактического действия;

. аминазин совместно с Т-активином обладают иммуно-корректирующим

действием и антисекреторной активностью ингибирующей

трансформацию аденозинтрифосфата (АТФ) в циклический 3,5-

аденозинмонофосфат (АМФ).

РАЗДЕЛ 2

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1.Общая методика. Экспериментальная часть работы выполнялась на

ферме крупного рогатого скота учебно-опытного хозяйства «Кетросу», района

Анений Ной, ОПХ «Колоница» района Криулень и в лаборатории микробиологии

кафедры эпизоотологии Государственного aграрного университета Молдовы с

1973 по 1998 год.

Опыты проводились на коровах черно-пестрой породы 5-8 лактации и на

родившихся от них телят, с целью изучения состояния неспецифической и

специфической иммунологической реактивности новорожденных телят при

колибактериозе, а также выявления роли кислотно-основного баланса в течение

инфекционного процесса, коррекции иммунодефицитного состояния новорожденных

телят. Для лечения применяли антисекреторные препараты, ингибирующие

циклический аденозинмонофосфат.

Пробы молозива отбирались в первый день (из первого, второго и третьего

доения), на второй, пятый день после отела, а на десятый, двадцатый день и

через месяц исследовалось молоко.

В сыворотке крови, молозиве и молоке изучались: динамика накопления

агглютининов, иммуноглобулиновый уровень, в т. ч. в динамике.

Сыворотку крови получали путем отстаивания, а из молозива — методом

пепсинизации. Из сывороток молозива первого и второго дня после отела

выделяли колостральную сыворотку и лактоглобулин. У родившихся телят от

опытных и контрольных групп коров в сыворотке крови изучали: динамику

накопления О- и К- антител-агглютининов, уровень иммуноглобулинов в

зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина,

комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5,

10, 20 и 30 день жизни).

Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови

новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и

лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на

лабораторных животных и телятах.

Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением

лактоглобулина и витамина А.

В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический

аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.

Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30

кроликах.

Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по

различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин,

А. А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А.,

1969].

2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена. Для приготовления

антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и

О137:К79.

Использованные серотипы Е. coli по морфологическим и биохимическим

свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным, антигенным н

вирулентным свойствам.

Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки с

мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков,

окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на

стерильный мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в

течение 18 ч при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали

стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена

бактериальную суспензию автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня

разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию Е. coli содержащую 10 млрд.

микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в

отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть

материала отбирали на воронке Бюхнера, промытой один раз ацетоном и затем

высушенной эфиром. Препарат высушивали на воздухе и хранили при 4°С.

Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1

мг высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.

Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из

агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 %

формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона

непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E.

A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter,

1957].

Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность.

Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы

выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была

проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили

10 белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в

области внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические

наблюдения за опытными животными вели в течение 15 дней.

Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных

позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены

при температуре +4 +5°С в холодильнике.

2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и

О137:К79 Е. coli. Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов

использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К-

антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих

дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.

Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей

соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной

баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.

Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя

формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение

сыворотки 1:10.

Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой

реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии

культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты

учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали

пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген

живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа,

в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в

течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную

реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O.

Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].

2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных

(коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в

термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной

температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в

стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).

Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела,

а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.

Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На

каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и

после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при

температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от

сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам

через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем

через бактериальный фильтр Зейтца.

2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В

центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина,

приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл

исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания

ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво

отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000

об/мин в течение 30 мин.

С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в

разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра

сыворотки. Контроли обычные.

Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и

помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили

предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через

24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.

2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления

агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию

агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в

пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами

(серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli ).

Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли

двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива

производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.

После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали,

затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого

производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки

выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный

результат.

Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех

крестовой системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то

наибольшее разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая

агглютинация, оцениваемая в четыре креста.

2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку

крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М

фосфатный буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора:

4,539 г х. ч. КН2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г

х. ч. Nа2НРО4Ч12Н2O, растворенный в 200 мл дистиллированной воды. При

смешивании этих растворов в определенном соотношении, получали рН буфера

6,2.

Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г

сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного

буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и

выдерживали 25-30 мин.

Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый

порошок Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема.

Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5

мл 1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения

однородной взвеси.

Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы

подучить толщину слоя 4 мм.

После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали

лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга.

Для подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин.

Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным

буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную

лунку в объеме 0,05 мл.

Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили

стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с

концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05

каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.

Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали

48 ч во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).

После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и

стандартным лизоцимом.

Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную

кривую, используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг

лунок с раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для

этого значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах,

откладывали по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима

в мкг/мл, вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и

вторых значений соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.

Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5 мм.

На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5

мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили

1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в

исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5Ч10=25 мкг/мл. Так как,

литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате

изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах

относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600

ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки

молозива равнялась 20,6Ч25 =515,0 ед/мл.

2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.

Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных.

Предварительно готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала

растворяли в 50 мл дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и

добавляли 8,5 г хлорида натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора

содержащего 1 М MgCl2 и 0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2Ч6Н2О г + 6 г

CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Буфер хранили в

холодильнике. Перед употреблением буфер разводили дистиллированной водой

(1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяли в 1 л

дистиллированной воды и фильтровали.

Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами

и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания.

Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты

барана отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из

отмытых эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и

стандартизовали на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых

эритроцитов добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты

фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая

плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.

Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение

гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из

этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000.

| |1:1000 |1:1200 |1:1500 |1:2000 |1:2500 |1:3000 |1:3500 |1:4000 |

|Буфер, мл |0,9 |1,1 |1. 4 |1,9 |2,4 |2,9 |3,4 |3,9 |

|Гемолизин |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |

Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5

% взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли

равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз

наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для

приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной

гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической

системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для

сенсибилизации эритроцитов барана.

Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и

доводили буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в

каждую пробирку добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть

сенсибилизированных эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная.

|Исследуемая сыворотка|0,05|0,1 |0,15|0,2 |0,25|0,3 |0,35|0,4 |0,45|0,5 |

|(1:10), мл | | | | | | | | | | |

|Буферный раствор |0,95|0,9 |0,85|0,8 |0,75|0,7 |0,65|0,6 |0,55|0,5 |

|Сенсибилизированные |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |

|эритроциты барана | | | | | | | | | | |

Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в

холодильнике 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали

на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли

процент гемолиза.

Для определения активности комплимента в гемолитических единицах

готовили шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл

стандартной 5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной

воды в результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 %

гемолиз). Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили

шкалу гемолиза:

|100 % гемолиз эритроцитов|0,1 |0,2 |0,3 |0,4 |0,5 |0,6 |0,7 |0,8 |0,9 |1,0 |

|на дистиллированной воде | | | | | | | | | | |

|Буферный раствор, мл |0,9 |0,8 |0,7 |0,6 |0,5 |0,4 |0,3 |0,2 |0,1 |0 |

|Гемолиз, % |10 |20 |30 |40 |50 |60 |70 |80 |90 |100 |

Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в

кюветах (1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от

процента гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси

ординат — показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.

Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим

образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в

течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и

центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей

комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если

содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда

титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3

мл, то расчет вели следующим образом.

0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 %

гемолитической единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки

содержится:

0,3 мл (1:10) — 1

1,0 мл — Х

Х =[pic] = 3,33 ел/мл.

2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для

определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили мединал-

вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В центрифужные

пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл

суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл

комплемента в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина

добавляли по 0,2 мл буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1

ч в термостат при 37° С, после чего центрифугировали, переносили

супернатант в отдельные пробирки по 0,3 мл и добавляли по 0,2 мл

стандартной гемолитической системы. Реакцию учитывали после 20-минутной

экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали то наибольшее разведение

сыворотки, в котором наблюдается полная задержка гемолиза, и в каком

разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз. Данные

рассчитывали по формуле:

|Разведение, в котором отмечен|— |Разведение, в котором отмечена |Ч10 |

|полный гемолиз в контроле | |полная задержка гемолиза в опыте| |

|Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле |

Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в

разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50,

содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:

[pic]Ч10 = 3 ед/мл.

Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую

активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и

молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук,

1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М.

Архангельский, 1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С.

Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А.

Емельяненко, В. Н. Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И.

Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В.

Павлов, Г. Н. Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В.

Биктимиров, 1993.

При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента

крупного рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к

исследованию, чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы

других литических факторов исследуемой пробы.

При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно

осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу

крупного рогатого скота.

Для определения пропердина использовали модифицированный метод

предложенный П. А. Емельяненко и др., 1980.

2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для

определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови

О. В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический

метод.

В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной

среды с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и

микробами сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой

инкубации.

Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и

выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали

стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до

содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев

на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной

температуре.

Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали

питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200

мг% амминного азота.

В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали

по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой

сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной

бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).

Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той

лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл

стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет

тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все

кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды

определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр.

После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно

определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24

ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной

дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови

проводили по формуле:

А=100- [pic]Ч100,

Где: А — бактерицидная активность (в %);

Д — оптическая плотность;

Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).

Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА)

по формуле:

Средняя НБА = [pic],

Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной

сыворотки;

А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3,

5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);

Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).

2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке

опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я.

Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в

термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в

течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим

раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до

2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной

бане при 70° С в течение 30 мин.

Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую

культуру Е. coli.

Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные

стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного

раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно

смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного

перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин,

предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С.

Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе,

нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по

Романовскому-Гимза.

Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду

усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия

(Na2HPO4Ч12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия

(KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды

прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен

6,813.

Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл

усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали

водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали

под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7Ч.

Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На

основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число

поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент

фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450

реакций.

2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови,

молозиве и молоке крупного рогатого скота.

Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г

натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4Ч12H2O) и 5,84 г хлорида

натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и

доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г

однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.

Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении

обеспечивающим рН буфера 8,0.

Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной

вены животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения

образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь

помещали на 16-20 ч в холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в

стерильную центрифужную пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000

об/мин.

Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4° С и

центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой

жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для

определения.

Пластинки из 3 %-ного агара «Дифко», смешанного с антисывороткой

готовили следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл

буфера и прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в

баню с холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали

смесь до полного расплавления агара.

После расплавления гель охлаждали до 56° С и к нему приливали равный

объем антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры

56° С. Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на

столике с уровнем в строго горизонтальном положении.

После застывания геля в нем делали лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15

мм друг от друга.

При определении содержания иммуноглобулина G пробы сыворотки крови

разводили буфером рН 8,0 в 20 и 30 раз. Пробы молозива первого дня лактации

в 100, 50 и 20 раз, пробы молозива последующих дней лактации — в 50, 20 и

10 раз, использовали не разведенные и разведенные в 10 раз пробы молока.

При определении содержания иммуноглобулина М пробы сыворотки крови и

молозива разводили в 10 и 5 раз, пробы молока использовали не разведенными

и разведенными в 5 раз.

При определении содержания иммуноглобулина А пробы сыворотки крови

использовали не разведенными, пробы молозива и молока — не разведенными и

разведенными в 5 и 2 раза.

Пробы сыворотки крови получали от новорожденных телят до приема молозива

во всех случаях использовали не разведенными.

Подготовленные пробы крови, молозива, и молока вносили в лунки геля с

антисывороткой с помощью пастеровской пипетки. При этом лунку заполняли

полностью, не переливая пробы за ее пределы.

Параллельно с опытными пробами на каждом стекле ставили контроль —

разливали в лунки стандартный препарат определенного иммуноглобулина. При

этом его разводили буферным раствором с таким расчетом, чтобы в 1 мл

раствора препарата содержалось 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мл белка.

Таким образом, на каждом стекле получалось 6 лунок с контрольной пробой

препарата.

После заполнения лунок, стекла помешали в эксикатор с водой и

выдерживали при комнатной температуре, при определении содержания

иммуноглобулинов G и А в течение 24 ч, а при определении иммуноглобулина М

— 48 ч.

По окончании сроков инкубации стекла извлекали из эксикатора и измеряли

диаметр кольца преципитата вокруг лунок с помощью линейки Беринг-Верке,

после окрашивания агаровых пластин. С этой целью стекла с агаром погружали

на двое суток в буфер. В течение этого срока буфер трижды заменяли новой

порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ, пластинки

агара высушивали при комнатной температуре под фильтровальной бумагой.

Затем пластинки (без фильтровальной бумаги) помещали в 0,1 %-ный раствор

амидо-черного 10В на 3 ч, промывали трехкратно раствором уксусной кислоты и

высушивали.

Для приготовления 0,1 %-ного раствора амидо-черного 10В, брали 1 г

краски, растворяли в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН), после чего

объем раствора доводили дистиллированной водой до 1 л. Раствор хранили в

темной посуде при комнатной температуре. Раствор уксусной кислоты для

промывания: брали 70 мл ледяной уксусной кислоты и доводили объем

дистиллированной водой до 1 л.

Для расчета содержания иммуноглобулинов в испытываемых пробах строили

калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге: на оси ординат

откладывали концентрацию белка в пробах стандарта, по оси абсцисс — диаметр

кольца преципитации. Калибровочную кривую строили отдельно по каждому

иммуноглобулину определенного класса.

Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяли путем сравнения

диаметра кольца преципитации вокруг ее лунки с калибровочной кривой [G.

Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; У. Дж. Герберт, 1974; В.

М. Чекишев, 1977; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М.

Н. Тулупова, 1980; P. В. Петров, 1987; Н. С. Жосан, 1989; Н. В. Матузенко,

Е. В. Андреев, А. И. Собко, 1990].

2.1.13. Экспресс-метод для определения содержания иммунных глобулинов.

Кровь получали от телят из яремной вены до приема молозива и через 24 ч

после рождения. Сначала ее выдерживали около часа в (30-35° С), а затем в

холодильнике 10-12 ч. После чего отделяли сыворотку в отдельные пробирки.

Раствор цинк сульфата (208 мг/л ZnSO4Ч7H2O) готовили в мерной колбе на

дистиллированной воде, которую выдерживали 4-5 дней и затем кипятили в

течение 10-15 мин с целью растворения диоксида углерода.

Для приготовления стандарта мутности брали 3 мл раствора хлорида бария

(BaCl2Ч2H2O) в 100 мл дистиллированной воды, вносили в мерную колбу на 100

мл и доводили до метки 0,2N раствором серной кислоты. Полученный раствор

соответствует 20 ед. цинк сульфатному тесту [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I.

E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

Калибровочную таблицу для калориметрического определения содержания

иммуноглобулинов на ФЭК-56М получали путем разведения стандарта мутности.

Для определения иммунных глобулинов подбирали пробирки одинакового

диаметра и наливали в каждую по 6 мл цинк сульфатного раствора, а в

контрольною пробирку — 6 мл дистиллированной воды. Во все опытные пробирки

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7