Литература - Другое (книга по генетике)

Литература - Другое (книга по генетике)

обозначение. Например, 441delA, 485insTA. При делеции или

инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их

число. Так, 852del22 означает делецию 22 нуклеотидов, начи-

ная с 852-го нуклеотида, а 3320ins7 обозначает вставку 7 пар

оснований после нуклеотида 3320. В случае больших вставок

или делеций их размеры указыаются в килобазах, например

2115ins13kb, или обозначаются соответствующие инсертирован-

ные/ делетированные структурные элементы генома. Так,

2115insAlu означает инсерцию Alu-повтора после нуклеотида

2115. При обозначении сплайсинговых мутаций записывают номер

крайнего нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нук-

леотидов (со знаком "+" в случае 3' конца экзона и со знаком

"-" в случае 5' конца) и характер нуклеотидной замены.

(Рис.4.1, Таб.4.2). Например, 711+5G-T обозначает замену G

на Т в 5-м основании интрона, следующего за экзоном, закан-

чивающимся 711 нуклеотидом.

Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-

тантных ДНК.

Идентификация мутантных аллелей, то есть обнаружение

нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК,

является самым прямым методом молекулярной диагностики

наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции,

дупликации, инверсии, транслокации - размером более 1 Мb,

затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут

быть обнаружены на цитологических препаратах с использовани-

ем техники высокого разрешения хромосомного анализа (анализ

дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще боль-

шая разрешающая способность (до 50 кb) может быть достигнута

при работе на специальным образом приготовленных (растяну-

тых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибри-

дизации in situ (FISH - Глава II).

Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов,

могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной

геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях гене-

тического анализа, предшествующих молекулярному клонированию

гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяжен-

ные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные

делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации,

локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием ре-

ализации метода блот-гибридизации для поиска подобных мута-

ций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью ге-

на, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной

ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную

ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепя-

щими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибриди-

зации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (Глава I) и

проводят сравнительный анализ расположения бэндов на ради-

оавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рест-

риктазы Msp1 и Taq1, которые узнают сайты CGGG и TGGA, соот-

ветственно. Благодаря наличию СpG последовательностей эти

сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию

(см.раздел 4.5). Наличие протяженных делеций, либо точечных

мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров

рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других то-

чечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и неболь-

ших структурных аномалий возможен только для клонированных

генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых

участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основа-

ны, главным образом, на использовании полимеразной цепной

реакции в её различных модификациях (см.Главу I, а также

разделы 4.5 и 4.6).

Для анализа мутантных аллелей, прежде всего, необходимо

иметь изолированные последовательности мутантного гена, ко-

торые могут быть получены либо путем клонирования или ампли-

фикации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплифи-

кации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей

гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК паци-

ентов (Рис. 4.2). В первом случае отбирают клонированные

к-ДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг

кДНК-овых библиотек, сконструированных из специфических тка-

ней или культур клеток больного. При этом в качестве зондов

используют кДНК-овые последовательности нормального гена.

Другим источником кодирующих последовательностей мутантного

гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих

тканей или клеток больного. Мутантную кДНК получают путем

специфической амплификации перекрывающихся последователь-

ностей кодирующих областей гена, используя в качестве матри-

цы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изо-

лированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то,

что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей,

нуклеотидные последовательности которых, как правило, стано-

вятся известны вскоре после идентификации и клонирования ге-

на. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в свя-

зи с недоступностью образцов тканей или органов, в которых

происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Од-

нако, обнаружение следовых количеств, так называемой, неза-

конной или эктопической мРНК во многих клетках и тканях, в

том числе в клетках крови, позволяет преодалевать и эти

трудности (Kaplan et al., 1992). Успех подобной процедуры

получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разра-

боткой эффективных методов выделения и обратной транскрипции

мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых

соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях

(например, мРНК дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна

(см.Главу X). Единственным принципиальным ограничением мето-

дов детекции мутаций в кДНК-овых последовательностях явля-

ются невозможность выявления мутаций в регуляторных и инт-

ронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены

только при анализе геномной ДНК пациента.

Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет

сложностей, так как она может быть изолирована из любых кле-

ток или тканей больного независимо от характера экспрессии

исследуемого гена. Однако, амплификация целых экзонов воз-

можна только при знании нуклеотидных последовательностей

фланкирующих интронных областей, из которых и производят

подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов

представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную

далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ог-

раничениям этого подхода следует отнести необходимость

достаточно полной информации о структуре гена и о его пер-

вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом

тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области

гена, отсюда для получения более полной информации необходи-

ма амплификация многих экзонов.

Стратегия идентификации мутаций может быть различной и,

в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее

неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини-

рование уже известных мутаций. В первом случае обектом

исследования чаще всего служат клонированные или амплифици-

рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку-

лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи-

руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.

Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого

секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов и часто

первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осу-

ществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже

был рассматрен ранее ( см.Главу I,раздел 1.6). Для некоторых

генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирова-

ния с успехом применяется как основной метод сканирования

мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его

применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по

размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертыва-

ния крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для

получения амплифицированных кДНК-овых фрагментов открывает

особенно широкие возможности для применения метода прямого

секвенирования.

Разработаные в последние годы модификации методов ПЦР

значительно облегчили секвенирование амплифицированных фраг-

ментов и повысили его эффективность. Так, в частности, пред-

ложен вариант ассиметричной ПЦР, когда при амплификации кон-

центрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз

превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего

синтезируется преимущественно только одна, нужная для секве-

нирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепо-

чечной ДНК) предложено использование магнитных частиц с

фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом

один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем

к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при-

шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -

стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси-

руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с

частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова-

тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще

в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме-

ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера-

зы. После амплификации в системе in vitro проводят

транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра-

зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования

- метод GAWTS (genome amplification with transcript

sequences).

Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной

кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель-

ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много

времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный

отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда

клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих

мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы

поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации,

основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных

последовательностей по целому ряду физических и химических

характеристик, которые в значительной степени варьируют в

зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под-

черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак-

тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле-

ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики

каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек-

венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из-

вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред-

варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре-

зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот-

кие фрагменты.

Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли-

ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения

легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про-

тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы-

явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри-

дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и

эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп-

ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз-

личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе-

рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни-

ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет

легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе

(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден-

тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо-

дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю-

шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро-

ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок-

рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в

исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут

отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег-

рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам-

плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от-

дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали-

зацию.

Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции,

находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в

аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова-

тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика-

ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле-

ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно

дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика-

ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод

идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на

использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу-

ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или

из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей

или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо-

лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны

сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб-

раны последовательности из этих областей гена, только му-

тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь-

шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо-

нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может

быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.

Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным

внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь-

зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию

фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали-

чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации

необычного размера.

Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к

отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их

размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при

электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или

агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется

для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му-

ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле-

ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест-

рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо

провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре-

деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после-

довательности по сравнению с нормальной.

При мутациях гена, представляющих собой замену одного

или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен-

тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими-

ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри-

мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор-

мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше-

ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо-

бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных

фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду-

щими из этих методов являются: метод анализа конформационно-

го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра-

диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп-

ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно-

го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования

Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3

Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер-

вичной идентификации мутаций.

-------T---------T--------T------------T----------------¬

¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦

¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+

¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------+---------+--------+------------+---------+------+

¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦

¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦

¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦

L------+---------+--------+------------+---------+-------

"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и

кДНК

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод

анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред-

ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на

регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-

нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся

вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа-

ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших

однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной

последовательности, так что замена даже одного основания в

молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост-

ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи-

ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований,

обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра-

зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек-

рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово-

дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения

ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме

используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT

Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с

этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се-

ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные

внешние факторы - температура, концентрация акриламида и

глицерина в геле, ионная сила буферных растворов

(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз-

воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК,

различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный

метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое

распространение благодаря своей простоте и возможности обна-

руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций

при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о.

составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400

п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме-

тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан

на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших

двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь-

ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых

фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ-

ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению

со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди-

намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж-

ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при

их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра-

диент денатурации достигается разницей температур, различной

концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих

условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК,

отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру-

ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю-

щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле-

отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При

электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в

геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату-

рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго

специфичной для данной последовательности области, эквива-

лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу-

ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью

может соединиться или разойтись. После начала плавления

продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля-

ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле-

кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не

наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит

разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному

составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около

50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до

нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при

прохождении ДНК через гель может начаться частичная денату-

рация концов молекул еще до достижения оптимальной области

плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов ам-

плифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на

процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффектив-

ность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатуриру-

ющего электрофореза может быть существенно повышена за счет

присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синте-

тических фрагментов GC-нуклеотидов, длиной в несколько

десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы

выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают

шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от

их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта моди-

фикация делает метод очень чувствительным (см.Таб.4.2). В

отличии от SSCP он пригоден для более крупных амплифициро-

ванных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600

п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает

95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута-

ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы

используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом

применен также для анализа индуцированных мутаций, так как

позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од-

ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме-

тода следует отнести техническую сложность получения равно-

мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном

геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных

GC-концов.

HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз-

воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или

в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля-

ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы-

ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных

хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо-

логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но

их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.

Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых

в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких

мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута-

ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в

том, что при амплификации относительно небольших фрагментов

генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может

быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич-

ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти-

пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль-

ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле-

кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав-

нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под-

вижности) за счет конформационных особенностей в местах

несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия

могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри-

ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо-

и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании

новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность

идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах

ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу-

ществляется как изотопным, так и неизотопными методами

(Grompe, 1993).

CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического

расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности

некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК

в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так,

цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к

действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода

используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.

Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву

молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций

осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих,

как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.

Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды,

клонированные последовательности ДНК или амплифицированные

фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).

При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме-

шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми

образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные

соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные

фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых

молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо-

вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах

ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации

между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК,

образуются места негомологичного спаривания. После обработки

соответствующими химическими агентами идентификация и лока-

лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово-

дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко-

роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео-

бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии

мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен-

тов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной

тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода

CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций

(Grompe,1993). Большими преимуществами этого метода являются:

(1) возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2

кб, (2) способность одновременно выявить и локализовать

несколько мутаций в одном фрагменте ДНК и (3) возможность

одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска

мутаций - мультиплексный вариант методики. К числу недостат-

ков можно отнести высокую токсичность используемых хими-

ческих реактивов. Последняя может быть частично ослаблена

использованием карбодиимида для идентификации GT гетеродуп-

лексов.

Весьма близким по принципу к CMC- методу является метод

расщепления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью созда-

ются условия для образования гетеродуплексов между тестируе-

мой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченой РНК про-

бой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул

РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных

мутаций определяются как и в случае СМС, по размерам образо-

вавшихся фрагментов после электрофореза и авторадиграфии.

Необходимость использования радиоактивно меченой РНК- пробы

и возможность детекции только около 50% точечных мутаций ли-

митируют широкое применение метода (Grompe, 1993).

Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена

путем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности

гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего

полипептидного продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК

из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, ампли-

фицировуют специфические экзоны кДНК (метод RT-PCR), встраи-

вают амплифицированную область ДНК в экспрессионную систему

и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно

эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содер-

жащих большое число экзонов, таких как ген миопатии Дюшенна

или ген нейрофиброматоза 1.

Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.

Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предпола-

гают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК

с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки

их фенотипического проявления и определения причастности к

развитию болезни. Поэтому они редко используются в практи-

ческой диагностике и при популяционном скрининге гетерози-

гот. После описания мутации появляется возможность ее анали-

за более простыми способами, не требующими секвенирования.

Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифициро-

ванных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного

электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.

Из миссенс мутаций наиболее просто диагностируются те

замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или об-

разованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз.

Они выявляются по изменению длины амплифицированного фраг-

мента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой.

Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компь-

ютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализа-

ции замены основания. Вероятность такого события довольно

велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в

настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания

служит своя специфическая последовательность ДНК, средние

размеры которой составляют 5 - 6 нуклеотидов.

Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации

найти не удается, то такие сайты могут быть созданы

искусственно. В частности, разработана методика создания с

помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но

не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного

сайт-направленного мутагенеза ( Ng et al., 1991; Eiken et

al.,1991). Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают

таким образом, чтобы 3'-конец одного из праймеров непосред-

ственно примыкал к мутантному сайту (Рис.4.8). Именно этот

праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем из-

меняют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании

с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом

месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эн-

донуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов

амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих дан-

ную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один

нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два до-

полнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрициро-

ванным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут

присутствовать только эти два фрагмента.

Концептуально близким к этому варианту является метод

получивший название "амплификация рефрактерной мутационной

системы"- amplification refractory mutation system - ARMS. В

основе метода лежит неспособность Taq1 термофильной полиме-

разы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия

(mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигоп-

раймеров (Newton et al.,1989; Bottema et al.,1990 ). Суть

метода заключается в оновременном проведении двух ПЦР, для

каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфи-

ческая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последова-

тельность, соответственно. При этом в качестве второго прай-

мера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же оли-

гонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях

могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяжен-

ности.Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распо-

ложен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает

предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим

из которых является концентрация ионов магния в растворе,

наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области прай-

мера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при на-

личии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные

фрагменты образуются только в том случае, если в качестве

аллель-специфического праймера выбирается мутантная последо-

вательность, тогда как при использовании нормального олиго-

нуклеотидного праймера ПЦР блокируется (Рис.4.9.). Метод на-

шел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетону-

рии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов

HLA системы. Однако, сложности в подборе праймеров и в выбо-

ре оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение

этого метода. Вместе с тем, его несомненным преимуществом

является возможность применения полностью автоматического

сканирования.

Таким же преимуществом обладают и методы детекции

состояния гена, основанные на лигировании синтетических оли-

гонуклеотидных зондов- OLA (oligonucleotide ligation assay).

При проведении этих реакций специфические ДНК или РНК после-

довательности исследуют путем использования их в качестве

матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотид-

ных зондов (Landegren,1993). ДНК-зонды для лигирования под-

бирают таким образом, чтобы они были полностью комплементар-

ны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации,

причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке

двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную

или флюоресцентную метку, а другой - метят биотином. После

гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные

олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из

термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при

высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях,

необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При на-

личии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из

зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, не-

посредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие тер-

минального неспаренного основания в смежно расположенных

последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лиги-

рования и при определенных условиях проведения реакции сшив-

ки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает

несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования

и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для

гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также

лигированные последовательности. В дальнейшем проводят

электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов

ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых ге-

нов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при

муковисцидозе.

Универсальным методом детекции замен оснований является

метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который

включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или

слот-гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонук-

леотидами (Reiss, 1991). Для этого синтезируют два типа оли-

гонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 пар

оснований, в которых мутантный сайт занимает центральное по-

ложение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплемен-

тарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соот-

ветственно. Условия гибридизации подбирают таким образом,

чтобы дуплексы образовывались только при полной комплемен-

тарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные

фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с

нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с му-

тантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами

(Рис.4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической

гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избы-

ток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.

Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием

аллель-специфических ДНК-зондов, меченых биотином или пе-

роксидазой хрена (Лебедева и др.,1994).

Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом скани-

рования точечных мутаций является модифицированный вариант

ASO, так называемая гибридизационная система обратного

дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki

et.al.,1989). Метод позволяет одновременно скринировать сра-

зу много точечных мутаций и доступен автоматизации

(Chebab, 1993). В этом случае проводят гибридизацию меченых

продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны,

с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфически-

ми олигонуклеотидными зондами (ASO). Предварительную иммоби-

лизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осу-

ществляют за счет присоединения гомополимерных T-хвостов с

дезоксирибонуклеотид-трансферазой на конце. При этом олиго-

нуклеотидные последовательности остаются свободными и могут

участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными

фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК ра-

диоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся

заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, пол-

ностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию,

обычно проводят в присутствии ионов тетра-алкиламмония,

уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции

оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия

гибридизации для различных олигонуклеотидов, то есть вести

поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном

и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разра-

ботки специальных систем, предназначенных для одновременной

детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом ге-

не. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с

нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соот-

ветствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со

смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут

содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для

аллель-специфифческой гибридизации. Таким способом сканируют

одновренно 42 мутации, ответственные за серповидноклеточную

анеми, 34 мутации при муковисцидозе (Сhebab,1993)

Очень простой метод обнаружения и идентификации

описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК

основан на анализе характера электрофоретического разделения

продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии

высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют форми-

рованию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем

расположение дуплексов очень специфично для различных му-

тантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифици-

рованном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с

высокой степенью вероятности идентифицировать известные му-

тации. В мультиплексном варианте методики возможен одновре-

менный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагмен-

тах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разра-

ботке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной ав-

томатизации процесса поиска и идентификации известных мута-

ций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций

Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и

постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному

анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровожда-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15