Литература - Другое (книга по генетике)

Литература - Другое (книга по генетике)

дают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК

в направлении 5' - 3', последовательно наращивая по одному

нуклеотиду к 3'-OH концу, причем точность синтеза определя-

ется специфичностью спаривания оснований. Таким образом, для

работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с

двухнитевым участком на 3'- конце молекулы. Кроме того, в

среде должны присутствовать четыре типа трифосфатов (dATP,

dCTP, dGTP и dTTP) - молекул, состоящих из основания -A,C,G

или T, сахара - дезоксирибозы (d) и трех фосфатных остатков

(P). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полиме-

раза альфа, а в клетках E. coli - ДНК-полимераза 111.

ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе

и экзонуклеазной в направлении 3' - 5', что позволяет им

исправлять - репарировать, дефекты, допущенные при подборе

комплементарных оснований. ДНК-полимераза 1 E. coli способна

инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомо-

логичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство использу-

ется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом

ник-трансляции.

Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонукле-

азной активностью - рестрикционных эндонуклеаз или рестрик-

таз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и

возможности генноинженерного манипулирования с молекулами

ДНК. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознования

и защиты "своих" и уничтожении чужеродных ДНК. Рестриктазы

узнают специфические последовательности из 4 - 6, реже 8 -

12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее

на фрагменты в местах локализации этих последовательностей,

называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рест-

рикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемос-

ти сайтов рестрикции, а их размер - характером распределения

этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще распо-

ложены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после

рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных

типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый

из этих ферметов узнает свою специфическую последователь-

ность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из

различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соот-

ветствующими первым трем буквам латинского названия вида

бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии отк-

рытия этого фермента у данного вида бактерий. В зависимости

от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК

различают три класса рестриктаз часто-, средне- и редкощепя-

щие. Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфи-

ческие последовательности (8-12 п.о.), как правило, являются

редкощепящими (например Nor1), а узнающие короткие (4-5

п.о.) - частощепящими (Taq1, EcoR1).

Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве

генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в ре-

зультатае рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по

длине путем электрофореза в агарозном или полиакриломидном

геле, и тем самым может быть определена их молекулярная мас-

са, а, значит, и физическое расстояние между сайтами. Напом-

ним, что обычным методом выявления ДНК в геле, также как и

РНК, является ее специфическое окрашивание, чаще всего эти-

диумом бромидом, и просмотр геля в проходящем ультрофиолете.

При этих условиях места локализации ДНК имеют красную окрас-

ку. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз

с последующим электрофоретическим анализом перекрывающихся

аддитивных по длине фрагментов ДНК можно добиться полного

упорядочивания сайтов узнавания для каждого из ферментов от-

носительно друг друга и каких-то иных маркеров, присутствую-

щих в исследуемой молекуле ДНК. Процесс этот называется фи-

зическим картированием и является обязательным элементом

анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относи-

тельно небольших фрагментов ДНК эукариот. На рис.1.2. предс-

тавлен простейший пример такого картирования в том случае,

когда в исследуемой молекуле ДНК присутствует по одному сай-

ту рестрикции для двух эндонуклеаз. После обработки исходной

ДНК отдельно каждой из рестриктаз образуется два фрагмента,

соответствующих по длине расстоянию от концов молекулы ДНК

до сайтов рестрикции. При совместной обработке обеими эндо-

нуклеазами на электрофореграмме появляется новый фрагмент,

размер которого соответствует расстоянию между сайтами рест-

рикции. Очевидно, что эти данные еще не позволяют однозначно

определить положение сайтов рестрикции по отношению к концам

молекулы ДНК. Однако, достаточно знать расположение хотя бы

одного маркера для того, чтобы произвести точное физическое

картирование исходной молекулы ДНК независимо от количества

локализованных в ней сайтов рестрикции.

При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, в

частности ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонукле-

азами образуется так много фрагментов различной длины (в

среднем, порядка 1 миллиона), что их не удается разделить с

помощью электрофореза, то есть не удается визуально иденти-

фицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме.

После электрофореза рестрцированной геномной ДНК получается

равномерное окрашивание по всей длине геля - так называемый

шмер. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле воз-

можна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Это

достигается при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну.

1.3. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.

Одним из наиболее эффективных методов идентификации

определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделен-

ных фрагментов является ставший уже классическим метод

блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора Edцuard So-

uthern, предложившего данный метод в 1975г . Последователь-

ные этапы данного метода представлены на Рис.1.3. Суть мето-

да заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрик-

ции одной или несколькими рестриктазами, после чего образую-

щиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агароз-

ном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатура-

ции in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно

нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам пере-

нос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных

сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на филь-

тре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым ДНК или РНК зон-

дом. Методом авторадиографии определяют положение искомого

фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридиза-

ция - высоко чувствительный метод идентификации специфичес-

ких последовательностей ДНК. При достаточно длительной экс-

позиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной

радиоактивности ДНК-зонда (более 10!9 расп/ мин/микроГ) этот

метод позволяет выявлять менее, чем 0,1 пикоГ ДНК. Так при

использовании зонда размерами в несколько сот оснований уни-

кальная последовательность в 1 000 п.о. может быть выявлена

в 10 микроГ геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной

полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12

часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олиго-

нуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хо-

рошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходи-

мость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокоме-

ченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей

процедуры делают её весьма дорогостоящей. Тем не менее, в

ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения в

том числе и для диагностики генных болезней. В последнее

время для этих целей нередко используют различные варианты

нерадиоактивного мечения или окраску ДНК азотно-кислым се-

ребром.

Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или

РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предвари-

тельной рестрикции и электрофореза носит название дот- или

слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на

фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На

рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих мето-

дов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с

электрофоретически разделенными молекулами РНК носит назва-

ние Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот - это

связывание электрофоретически разделенных белков, фиксиро-

ванных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих ме-

тодов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Сау-

зерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен-

тальных подходов, используемых для анализа ДНК.

В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зонда-

ми не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.

Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на

фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромо-

сомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in

situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов исполь-

зуются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называ-

ется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый

ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и

подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафаз-

ных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена

на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение

имеет также подбор условий, максимально способствующих про-

цедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК

и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании

радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обра-

ботки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК

зондов) места локализации последовательностей ДНК, компле-

ментарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно

наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответс-

твующими участками определенных хромосом (Рис.1.4).

Гибридизация in situ, является одним из наиболее эф-

фективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду

последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно

эффективна при исследовании распределения по геному повторя-

ющихся последовательностей ДНК, клонированных последователь-

ностей ДНК анонимного происхождения, при определении не

только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной

локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются

соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность

метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Сог-

ласно последним данным, в экспериментах на специально приго-

товленных и растянутых интерфазных хромосомах человека раз-

решающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что

составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного

бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов

ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успе-

хом решаются методом FISH.

Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми

зондами, проводимая на гистологических препаратах, является

одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифи-

ческого распределения и внутриклеточной локализации мРНК

(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными мето-

дом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их

многочисленными модификациями и вариантами можно ознако-

миться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,

1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.

ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК огра-

ниченного размера, используемая для поиска комплементарных

последовательностей в молекуле большего размера или среди

пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве

зондов используют искусственным образом синтезированные оли-

гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно

не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить вы-

деленные из генома последовательности ДНК. Однако значитель-

но чаще такие последовательности предварительно клонируют,

чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неог-

раниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание

(инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу

ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бакте-

риальные клетки хозяина (Рис 1.5). Химерные молекулы ДНК,

составленные из фрагментов разного происхождения, носят наз-

вание рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов

используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро-

и аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс-

трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от со-

тен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, глав-

ным образом, способностью вектора удерживать чужеродный

фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов

плазмидную ДНК.

Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные мо-

лекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе

копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с

изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока-

залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие

клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря

чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз

и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются

плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заме-

тим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе

не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как

при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штам-

мы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды

имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую

поддержание их количества в клетке на определенном уровне -

от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.

Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным

контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клет-

ке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клони-

рующих векторов заключается во внесении изменений в систему

контроля репликации и в добавлении или вырезании генов анти-

биотикоустойчивости или удобных для клонирования иных гене-

тических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициа-

ции и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро-

вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.

Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести

в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализа-

ции уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраива-

ние, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной

молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов

-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает коль-

цевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные

методы трансформации бактерий, то есть искусственного введе-

ния плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие

в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в ка-

честве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на

соответствующих селективных средах. При размножении

трансформированных бактерий происходит увеличение числа ко-

пий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чу-

жеродный для бактерий генетический материал может быть полу-

чен, практически, в любых количествах. Выделенная из бакте-

рий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро-

ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в ка-

честве ДНК-зондов.

Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов

оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.

Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при

ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с

чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто техни-

чески эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако,

размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью го-

ловки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают

последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна-

чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может су-

ществовать только в том случае, если в него встроена чуже-

родная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой

ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на

основе фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.

Многие проблемы молекулярной генетики успешно решаются

с использованием экспрессионных векторов, содержащих в своем

составе регуляторные последовательности, обеспечивающие син-

тез чужеродных белков в клетках хозяина. Так в случае лямбда

gt11 фаги могут быть выращены в, так называемых, репликатив-

ных условиях, обеспечивающих экспрессию инсертированной ДНК.

Так как обычно ДНК встраивают в район локализации маркерного

гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то

экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть поли-

пептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а

часть цепи будет транслироваться в соответствии с информаци-

ей, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок мо-

жет быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного

белка либо с помощью антител к специфическим участкам, коди-

руемым чужеродной ДНК.

В последнее время большое распространение получило

клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе

преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе

плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда,

отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы

могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фа-

говых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей

способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами

и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной

ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клониро-

вания в прокариотических системах.

Векторы, пригодные для направленного переноса в эука-

риотические клетки, конструируют на основе прокариотических

или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в

клетках эукариот, а также используют различные эукариоти-

ческие вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аде-

ноассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка-

честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последова-

тельности, ответственные за начало репликации. Введение век-

торов в эукариотические клетки часто осуществляют путем

ко-трансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и

сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, вве-

денные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение

нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул -

эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК

в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последователь-

ности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и насле-

дуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).

Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со-

держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихро-

мосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial

yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векто-

ров, содержащих в своем составе известные центромерные и те-

ломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые

для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Та-

кие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК

размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар осно-

ваний.

Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки

хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как

уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные

клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осущест-

вляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс

введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется

трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий,

облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через

клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости

мембран используют два разных подхода. В первом случае про-

водят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными

растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных

мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,

DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае

используют краткосрочное физическое воздействие на клетки

для создания в мембранах микропор, проходимых для макромоле-

кул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным

электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и

т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетичес-

кой трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Воп-

росам молекулярного клонирования также посвящена обширная

литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Мани-

атис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.

Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи-

кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для

использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником

этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро-

ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или

скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в

зависимости от специфических особенностей этих последова-

тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных

перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате

рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде-

ленной из какого-либо специфического источника. В зависи-

мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые

библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис-

пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от-

дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК

-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль-

тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-

ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об-

ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её

разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.

Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-

тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте-

ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге-

нов, но также несмысловые внутригенные последовательности -

интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-

рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки

состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-

иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-

ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч

пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-

щихся последовательностей геномной ДНК человека получается

после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или

Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-

личество клонов с различными инсертированными фрагментами

ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-

мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в

одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные

библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -

10!6 различных клонов.

Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или

космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче

хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-

отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на

основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая

способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много

удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут

быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-

ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто

используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-

ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не

вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для

создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,

используется технология искусственных дрожжевых хромосом

-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)

фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-

нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-

ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных

ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или

космидных библиотеках.

Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на

фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными

ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека

сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).

Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают

на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-

зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-

зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.

Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие

чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры

и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят

их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-

ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-

тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-

тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на

рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-

зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК

последовательности, комплементарные зонду, или специфические

антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных

культурах производят именно в тех местах, где произошло по-

темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,

отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-

нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и

субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать

большие количества этой ДНК.

1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.

Следующими этапами анализа отобранного и клонированного

ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-

ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-

ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-

ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул

ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,

однако, определение нуклеотидной последовательности протя-

женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-

дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-

ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -

метод Сэнджера. В первом случае используют химическое

расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют

нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез

на заданном основании.

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так

как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-

го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-

руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют

секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-

нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-

ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-

ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного

участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную

смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,

один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-

рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют

один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов

- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на

место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.

Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-

щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и

тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-

ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-

ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-

рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов

может быть определен, а значит и определена локализация ди-

дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов

в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем

геле может быть определена первичная последовательность все-

го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте

этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.

Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК

в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет

назад оценивалась в 1$.

В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-

варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных

на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых

участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-

ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-

залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс

одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-

шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология

автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным

для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-

лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-

нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-

ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается

автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение

в реализации программы Геном человека. По последним данным,

разработка автоматических секвенаторов позволила снизить

стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-

ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах

фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-

но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.

В последние годы активно разрабатываются принципиально

новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-

ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой

последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-

ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский

и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для

этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых

пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-

да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-

рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-

деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество

возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-

емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют

с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется

только с теми октануклеотидами, последовательности которых

комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-

бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-

дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной

компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-

тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод

позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет

автоматизации процесса.

1.7 Полимеразная цепная реакция.

До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-

рование являлись единственными способами поиска и выделения

специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей

ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о

большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи-

альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые

фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш-

ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих

последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так

как определяются наличием соответствующих рестрикционных

сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе-

ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое

количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК

(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК

обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока-

зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях

и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед-

ленного использования собранной крови для выделения ДНК или

хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова-

ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи-

вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент-

ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не-

обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив-

ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны

быть использованы в течение очень короткого периода после их

приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом

требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали-

чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно

лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не-

обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд-

линяет время получения результатов, что также ограничивает

использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди-

агностики плода, специфика которой во многом определяется

сроком беременности.

Предложенный в 1983г. американским исследователем

Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской

премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -

метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным

открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или

специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте-

зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной

от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,

реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые

образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук-

леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,

так как специфический выбор этого участка осуществляют путем

гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-

ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями

ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-

концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой

нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между

праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка-

честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип

ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов

про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери-

альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для

проведения специфической амплификации не требуется больших

количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной

молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в

значительной мере связан с использованием в качестве фермен-

та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,

выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по-

тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,

1987).

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока-

зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая

матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг-

ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю-

щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно

проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации

или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,

комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-

шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за

счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50

С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго

специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе-

ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С,

начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого

участка, образованного праймерами. Затем при нагревании

раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух-

нитевой участок между матричными и вновь синтезированными

молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле

олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за-

тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку-

лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу-

чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного

режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро-

ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер

вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного

нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат-

ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для

амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации

в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из

процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой

реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят-

ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится

от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синте-

зированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР

обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого

специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.

Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и

выбирать оптимальные временные и температурные параметры для

каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы

возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень

проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме-

ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля-

ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают

небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст-

вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной

смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую

программу циклической смены температуры и длительности каж-

дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,

составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального

режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи-

цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для

каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,

длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич-

ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой

термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и

состав амплификационной смеси могут существенно варьировать

и зачастую подбираются эмпирически.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15