Литература - Другое (книга по генетике)

Литература - Другое (книга по генетике)

1993 ¦

дегенерация Вильсона-¦ ¦инсерция -14;Мажорные -¦Petruchin et

al., 1993 ¦

Коновалова, ¦Медь-транспор-¦H714Q - 31% в Америке, ¦Tanzi et al.,

1993 ¦

277900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% в России; 1 н. дел.¦Thomas et al.,

1995 ¦

ATP7B.34; ¦за P типа 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦

¦

---------------------+--------------+-----------------------+---------------

----------

Многим из приведенных в Табл.9.4 заболеваний посвящены

обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие

наряду с клиническими данными специальные разделы, посвящен-

ные молекулярной природе патологического процесса, характе-

ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а

так же последним достижениям и перспективам лечения, включая

генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомя-

нуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы

в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же

упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моно-

генными болезнями, которые были исследованы молекулярными

методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разра-

ботаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных

особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна му-

таций оптимальные схемы молекулярной обследования семей

высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления

гетерозиготного носительства. Практически все эти исследова-

ния проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Ге-

ном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор

отечественных работ по молекулярной диагностике наследствен-

ных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов,

1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов,

1993).

10.4.1 Муковисцидоз.

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) -

самое распространенное моногенное наследственное заболевание

у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь,

молекулярные основы которой определены методами позиционного

клонирования без использования каких-либо данных о структур-

ных перестройках в области локализации предполагаемого гена.

Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или

крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значи-

тельно облегчает его картирование и идентификацию, как это

было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом

грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хро-

мосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об

истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе

функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следую-

щих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Бара-

нов, Гинтер, 1994).

Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный бе-

лок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane

regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных ка-

налов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб-

раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от

типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муко-

висцидозе может быть полностью или частично нарушенной.

К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500

мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распростра-

ненной у жителей Западной Европы и Северной Америки является

мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508

положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 нахо-

дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи-

вает определенный градиент распространения с севера на юг и

с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до

50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части

России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро-

мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является

мутация W1282X (33%).

Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко-

висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности

экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде-

ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле-

точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута-

ции, её локализации и структуры аномального белкового про-

дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не-

которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя

трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости-

гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим

объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару-

шениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W

и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не

затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но

функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление

процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х ли-

ниях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и

двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной

из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией

функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказа-

лось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализа-

цию и стабильность белка и снижает эффективность его функци-

онирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993).

Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще

в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обна-

руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя-

щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза

у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер-

та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия,

обусловленного аллельными сериями.

В настоящее время в России доступны идентификации по

наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом

(Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность

основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле-

дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),

394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на-

шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко-

висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се-

мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные

сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости

(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми-

нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена

СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et

al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При

отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным

сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи-

мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер-

ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;

Баранов и др.,1991).

Методами направленного мутагенеза (gene targeting

см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании

осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей

муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et

al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы-

яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия

проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано,

что различные мутации этого гена по-разному реализуются в

фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных

линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других -

поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии

наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход-

ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии

представляют собой идеальные модели для исследования молеку-

лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ-

ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте-

рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге-

нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7

центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и

Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген-

ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо-

дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические

испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70

пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача-

тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль-

тур.

10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.

Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная

дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - мио-

дистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию

Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых

крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин,

входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист-

рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре

после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин

присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном

состоянии.

В соответствии с современными представлениями (Ahn,

Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож-

ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней

мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную

специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и

на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора

экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время

как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю-

чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6-

и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси-

руются, образуя несколько структурно различающихся форм

дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи-

цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще-

еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка-

нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок

значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото-

рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в

мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса,

экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в

Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам

дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу-

чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще

один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро-

фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et

al., 1993).

В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи-

ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до

нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух

"горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и

в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова-

ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси-

мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене-

зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.

Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как

изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях

повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной

делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4%

(Passos-Bueno et al., 1992).

Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в

разных европейских популяциях, а также в популяциях России и

стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де-

летирован не только весь ген, но достаточно протяженные

соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в

центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44,

протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз-

рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной

из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб-

ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо-

зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко-

торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы,

размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов-

торены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза неста-

бильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подоб-

ного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких

случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у паци-

ентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть

имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В

2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сик-

венс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов.

В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не-

гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).

Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и

протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор-

мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием

или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо-

жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки -

дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена

дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута-

ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук-

леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий

процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с

присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му-

тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.

Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с

МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи-

мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен-

ные формы.

Разработаны очень эффективные методы диагностики деле-

ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре-

менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз-

воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et

al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де-

леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи-

ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп-

лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование

(Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод

иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на

гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et

al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют

косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген-

ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;

124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид-

ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше-

ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и

др., 1990).

Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного

носительства и, следовательно, для медико-генетического

консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад-

ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад

женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою

очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов)

половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами

дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни-

кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран-

них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори-

ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа-

ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце-

нить величину аберрантного клона ооцитов практически не

представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении

здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери

больного МД не удается определить гетерозиготное носительст-

во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали-

чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при

отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного

носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно-

го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et

al.,1992).

У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто-

химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро-

фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител

с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным

участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-

вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят-

ный механизм такого явления - возникновение второй сомати-

ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки

считывания, вызванный основной делецией. В результате му-

тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль-

ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).

Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -

mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,

спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,

1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается

резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол-

ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини-

ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована

нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей

транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже-

на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо-

на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).

В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи-

альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина

человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали

после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер-

ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро-

фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив-

ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,

1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-

венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант-

ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной

ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных

(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче-

видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да-

лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты

исследователей о перспективности генной терапии МД по срав-

нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных

миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини-

ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу

IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи-

мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро-

фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен-

но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования

по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и

в нашей стране.

10.4.3 Гемофилия А.

Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное

наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в

системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора

YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х

компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном

F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-

зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-

ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-

рует его активность.

Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-

жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая

длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-

дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009

нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность

(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806

п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в

интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-

известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами

молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-

роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в

направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый

экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие

его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется

он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена

экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;

Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22

оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-

ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-

тельное место локализации бинаправленного промотора для ге-

нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб

в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые

копии гена F8A (Lakich et al.,1993).

Во время процессинга первичного белкового продукта гена

F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-

щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В

плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого

гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и

N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с

гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-

личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-

тивность белка сохранена, но его количество резко снижено

(McGinnis et al.,1993).

Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -

семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают

в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal

et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,

что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-

ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме

того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,

могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что

вероятность повторного рождения больного ребенка у них также

повышена.

Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв-

ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При-

мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика-

ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis

et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова-

на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло-

кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них

представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,

Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах

встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на

основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего

большинства мутаций гена F8C характерно практически полное

отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по

гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение

составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя-

женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол-

ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа-

лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А

(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена

является гомологичная рекомбинация между идентичными после-

довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22

F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на

расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).

Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре-

гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,

связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен-

тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен-

ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк-

зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et

al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1

последовательности представляют собой специфическое для ге-

нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов-

торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и

состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба

L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот-

ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et

al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10

F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле-

мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре-

конструируемые аминокислотные последовательности были высоко

идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.

Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде-

ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую-

щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-

зиции.

Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу-

ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c

последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1

(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия

мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные

методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют

полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по-

лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне-

генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,

1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).

Учитывая наличие функционально активной формы белка

фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии

этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-

ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо

на введение в организм больного соответствующей кДНК,

обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу-

ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого

гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о

получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен

ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты

полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо-

левания находится на стадии экспериментальных разработок

(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов

человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная

проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив-

ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена

могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены

невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель-

ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож-

ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,

гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап-

равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные

модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что

клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач-

нутся уже в ближайшем будущем.

10.4.4 Гемофилия B.

Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван-

ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента

средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок

(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных

остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-

лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак-

тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по-

липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно

связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX

циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не

произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего

пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се-

риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак-

тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль-

ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо-

ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо-

кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.

Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни-

кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et

al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от

отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо-

лированном случае вероятность гетерозиготного носительства

мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая

корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от

него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в

момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав-

ляет около 42 лет (King et al.,1992).

К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге-

мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти-

дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию

стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-

раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной

частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети-

лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG

динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота

G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в

других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG

динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии

(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание

(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema

et al., 1991).

В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофи-

лии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяжен-

ности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или

акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты

сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена

произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5

(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промо-

торной области гена F9. Именно с такими мутациями связана

Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к воз-

расту половозрелости наступает улучшение многих клинических

показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.

Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут

приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на

стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного

ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству

транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия B была использована как модель для выработки

стратегии генетического консультирования при моногенных за-

болеваниях, обладающих выраженной мутационной гетероген-

ностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии яв-

ляется составление национальных баз данных молекулярных де-

фектов и специфических методов их диагностики. В частности,

основываясь на подобной информации, авторы провели характе-

ристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с

гемофилией B шведского и английского происхождения и только

в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как

непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно-

вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:

Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма

в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в

положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у

60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин

и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли-

фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей

детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации

(Montadont et al.1990).

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко-

вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных

биологических моделей способствовали быстрому прогрессу

исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее

время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-

ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в

опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных

системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве-

дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в

первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали

экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.

После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы-

шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся

в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et

al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена

трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком-

бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При

этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение

более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер-

тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об

успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным

мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич-

ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo

рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный

скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа-

листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи-

лии В - событие самого ближайшего будущего.

10.4.5 Болезнь Виллебранда.

Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото-

рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное

наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору

VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как

фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-

ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК

составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров

с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.

Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу-

дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде-

ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син-

теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак-

тора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и

III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент-

рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.

Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре-

цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив-

ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора

VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать

большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско-

рости их выведения из плазмы (тип IIB).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов,

размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи-

на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000

пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются

первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица

VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35

экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после-

довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA

повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены,

кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На

хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,

соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,

1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му-

тации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II

болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены

аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций

в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,

1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA

кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован

сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе

IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар-

ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая

группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег-

менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного

изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.

При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи-

лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма-

лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с

фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру-

ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую-

щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС

(Mazurier, 1992).

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо-

левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.

Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози-

готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в

одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом

же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки

считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци-

тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута-

ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон

Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов-

ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде

с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между

геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо-

лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра-

вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг-

ностики и результатами медико-генетического консультирова-

ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле-

дования заболевания в семье высокого риска и установить его

форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,

а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа-

ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с

тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве-

ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются

экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et

al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не

обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся

(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек-

тивной на современном этапе представляется непрямая диаг-

ностика. В промоторной части гена, в интронах

15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти-

фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с

достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек-

тивным для диагностики является полиморфизм интрона

40, представляющий собой две области варьирующих по числу

тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика-

ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с

последующим электрофоретическим разделением позволяет иден-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15