РУБРИКИ

Литература - Другое (книга по генетике)

   РЕКЛАМА

Главная

Логика

Логистика

Маркетинг

Масс-медиа и реклама

Математика

Медицина

Международное публичное право

Международное частное право

Международные отношения

История

Искусство

Биология

Медицина

Педагогика

Психология

Авиация и космонавтика

Административное право

Арбитражный процесс

Архитектура

Экологическое право

Экология

Экономика

Экономико-мат. моделирование

Экономическая география

Экономическая теория

Эргономика

Этика

Языковедение

ПОДПИСАТЬСЯ

Рассылка E-mail

ПОИСК

Литература - Другое (книга по генетике)

чены. Отличительной особенностью мобильных элементов явля-

ется способность существовать как в интегрированном с хро-

мосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом,

плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мо-

бильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последо-

вательности составляют около 12% гаплоидного набора

(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50

000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около

6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от

300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных

элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизоге-

нии, то есть присутствие вирусных последовательностей в

составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в

вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и

возможности "горизонтальной" передачи наследственно закреп-

ленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило,

относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не

существует четких границ между облигатными и факультативными

элементами генома, так как возможен взаимный переход от од-

ного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты

хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы

за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или

путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Об-

ратный переход от факультативных элементов к облигатным осу-

ществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных

перестроек и обратной транскрипции.

Факультативные элементы существуют в геноме как популя-

ции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них

под воздействием внешних факторов, носят совершенно иной ха-

рактер по сравнению с классическими мутациями в структурных

локусах. Для описания изменений в факультативных элементах

предложен термин " вариации" (Голубовский, 1985). Этот тер-

мин впервые использован Жакобом и Воллманом для описания по-

ведения эписом (Jacob, Wollman, 1961). Вариации могут приво-

дить к изменениям на генотипическом уровне, то есть к мута-

циям, вследствие простого перемещения факультативных элемен-

тов или сдвига в соотношении между факультативными и обли-

гатными элементами. В этих случаях мутации встречаются од-

новременно у многих индивидуумов. Подобные изменения упоря-

дочены, могут происходить сразу во многих локусах и отлича-

ются высокой сайт-специфичностью. Локализация структурных

перестроек, возникающих в результате вариаций, предопределе-

на первоначальной топографией факультативных элементов на

хромосомах. И наконец, сами вариации могут быть индуцированы

обычными "не-мутагенными" факторами, такими как температура

или межлинейные кроссы (Golubovsky, 1995). Факультативные

элементы могут рассматриваться как оперативная память гено-

ма, так как во многих случаях спонтанное возникновение мута-

ций в облигатных элементах опосредовано их активацией. Счи-

тается, в частности, что инсерционный мутагенез является

причиной спонтанного возникновения 70% видимых мутаций в

природных популяциях дрозофилы. Однако, у человека пока за-

регистрированы лишь единичные случаи возникновения мутаций

вследствие перемещения мобильных элементов генома (Vidaud et

al.,1993).

Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные

сайты.

Перечисленные выше компоненты генома не случайным обра-

зом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом

смысле можно говорить о существовании в геноме человека

структур более высокого иерархического порядка. Примером

служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты

ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.

62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано

около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохора-

ми, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных

GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо-

дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,

1993). Таким образом, существуют относительно небольшие

участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше,

чем в остальных последовательностях.

Другой общей чертой генома человека является то, что in

vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК

метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити-

дина. Экспериментальное изучение характера метилирования

основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую-

щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты

узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но

действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того,

находится ли это основание в метилированном состоянии или

нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после-

довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля-

ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили-

рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к

повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в

местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' -

сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается

характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3'

последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные

индивидуумы, независимо от их этнического происхождения,

практически не различаются по характеру метилирования ДНК в

одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене-

тической дифференцировки происходят значительные изменения

рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу-

холевого происхождения число метилированных сайтов резко

уменьшено.

Высказано предположение о наличии прямой связи между

метилированием ДНК и состоянием генетической активности в

клетках. Существует класс белков, которые специфическим об-

разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их

недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз-

можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен-

тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации

эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив-

ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области

генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде-

тельствует о функциональной активности генов. Показано, что

необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная

ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа-

ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети-

лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са-

мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а

также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге-

номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности

некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть

прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба-

ранов, 1991).

В GC-богатых изохорах локализовано большое количество

CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха-

рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина

(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован-

ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов,

родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных

факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;

Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов

узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы

HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих

неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%

Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,

CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь-

ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки-

пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв-

ляются характерной особенностью транскрибируемых участков

генома. Их идентификация в клонированных последовательностях

геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных

структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG

островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,

15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр-

ные методы регистрации СрG островков показали, что их число

в геноме человека приближается к 45000 (

Antequera,Bird,1993).

Можно также отметить существование в геноме человека

сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур-

но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та-

ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви-

димому, это необходимое, но не достаточное условие их

экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме-

няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко-

торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион-

ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи-

тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа-

ях это области функционально активных генов, находящихся в

деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.

Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви-

тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод

ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро-

мосомных препаратах визуализировать функционально активные

районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба-

тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по-

мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече-

ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно

только в те участки хромосом,где находятся функционально ак-

тивные гены (Verma, Babu, 1989).

ГЛАВА II.

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-

тов.

Термин геном используется для обозначения полной гене-

тической системы клетки, определяющей характер онтогенети-

ческого развития организма и наследственную передачу в ряду

поколений всех его структурных и функциональных признаков.

Понятие генома может быть применено к таксономической груп-

пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви-

русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про-

кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности

строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из-

менениями, происходящими в геноме специфических клеток в

процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном

определяется как генетическая информация, заключенная в мо-

лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как

отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид-

ный геном и таксономическим статусом видов, а также много-

численные примеры существования огромных различий в содержа-

нии ДНК между близкородственными видами (так называемый

"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все

участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге-

нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как

основные принципы организации и функционирования генома це-

ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам

потенциальные возможности практически неограниченного струк-

турного разнообразия определяют все многообразие мира живых

существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз-

личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).

Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как

правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге-

нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло-

кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК,

приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ-

ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь-

ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа-

бильность и филогенетический консерватизм первичной структу-

ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома

достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи-

вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения,

вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших

участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не-

экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов,

межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).

Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как

мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли-

гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу

облигатных элементов составляют структурные локусы, коли-

чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.

Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК,

амплифицированных участков, ретровирусных последователь-

ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет-

ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз-

личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля-

ется не строго обязательным, их количество и положение может

значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа-

культативными. В то же время участие факультативных элемен-

тов в наследственной передаче признаков, в формировании му-

тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви-

дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный

переход от одних состояний к другим за счет инсерции

экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо-

ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно,

несмотря на значительные отличия факультативных последова-

тельностей от облигатных по характеру основных информацион-

ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре-

гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле-

менты генома.

Остановимся теперь более детально на основных принципах

организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46

хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина

гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар

нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для

кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим

независимым оценкам истиное число структурных генов нахо-

дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе-

ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко-

личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная

оценка их числа составляет около 80 000. Сопоставляя это

значение со средними размерами гена и соотношением между ве-

личиной их экзонных и интронных областей, можно заклю-

чить,что кодирующие последовательности ДНК занимают не более

10-15% всего генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким образом,

основная часть молекул ДНК не несет информации об амино-

кислотной последовательности белков, составляющих основу лю-

бого живого организма, и не кодирует структуру рибосомаль-

ных, транспортных, ядерных и других типов РНК. Функции этой

"избыточной" (junk) ДНК не ясны, хотя ее структура изучена

достаточно подробно. Предполагается, что эта ДНК может

участвовать в регуляции экспрессии генов и в процессинге

РНК, выполнять структурные функции, повышать точность гомо-

логичного спаривания и рекомбинации, способствовать успешной

репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально

иного генетического кода с неизвестной функцией.

Наиболее общая характеристика генома может быть получена

с помощью анализа кинетики реассоциации молекул ДНК. Динами-

ка плавления геномной ДНК обнаруживает присутствие по край-

ней мере трех различающихся по химической сложности фракций

(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Быстро ренатурирую-

щая фракция ДНК состоит из относительно коротких высокопов-

торяющихся последовательностей; в промежуточную фракцию вхо-

дит множество умеренно повторяющихся ДНК - более протяжен-

ных, но представленных меньшим числом копий; медленно рена-

турирующая фракция объединяет в себе уникальные последова-

тельности ДНК, встречающиеся в геноме не более 1-2 раз.

С помощью молекулярного анализа проведена идентификация

основных классов повторяющихся последовательностей ДНК,

составляющих более 35% всего генома человека и включающих

сателлитную ДНК, инвертированные повторы, умеренные и низко-

копийные повторы, а также мини- и микросателлитные последо-

вательности ДНК. Классификация этих типов повторов достаточ-

но условна и основана, главным образом, на двух характе-

ристиках: длине повторяющихся коровых единиц, которая может

варьировать от 1-2 до более, чем 2000 п.о., и числе их ко-

пий, также меняющихся в очень широких пределах - от десятка

до миллиона на гаплоидный геном. Не менее важными характе-

ристиками различных классов повторяющихся ДНК являются нук-

леотидная последовательность "коровых" единиц повтора, спе-

цифичность их организации, хромосомная локализация, внутри-

и межвидовая стабильность, а также возможные функции этих

типов ДНК.

Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности ДНК.

Сателлитная ДНК это класс высокоповторяющихся последо-

вательностей, составляющих около 10% всего генома человека

(Kao, 1985). При центрифугировании геномной ДНК в градиенте

плотности CsCl эти последовательности образуют четыре от-

дельных сателлитных пика с различными средними значениями

плавучей плотности. Методом гибридизации in situ показано

присутствие сателлитной ДНК преимущественно в центромерных,

теломерных и гетерохроматиновых районах большинства хро-

мосом, при этом характер гибридизации сходен для всех четы-

рех групп и не зависит от принадлежности ДНК-зондов к се-

мействам повторов, образующих различные сателлитные пики. В

каждой из этих групп, однако, присутствует небольшое коли-

чество последовательностей, имеющих специфическую хромосом-

ную локализацию. Так например, около 40% длинного плеча Y

хромосомы составляет семейство последовательностей, тандемно

повторяющихся более 3000 раз и не найденных в других хро-

мосомах.

Выделяют три основных типа сателлитной ДНК: (1) короткие

- от 2 до 20 п.о., стабильные тандемные повторы с кратностью

в несколько десятков тысяч раз, которые иногда перемежаются

с неповторяющимися последовательностями; (2) кластеры более

протяженных повторов, слегка различающихся по нуклеотидной

последовательности; (3) сложные, достигающие нескольких со-

тен пар нуклеотидов, повторяющиеся последовательности раз-

личной степени гомологии (Газарян,Тарантул,1983). К послед-

нему типу относятся альфа-сателлитные или альфоидные ДНК,

среди которых найдено много хромосом-специфических последо-

вательностей. Размеры повтрояющихся "коровых" единиц альфо-

идной ДНК составляют около 170-200 п.о. В геноме человека и

других приматов эти мономеры организованы в кластеры по 20 и

более "коровых" единиц. После расщепления рестриктазой BamHI

в альфоидной ДНК выявляется серия фрагментов, длиной около 2

000 п.о., в составе которых обнаруживаются альфоидные после-

довательности, специфичные для гетерохроматиновых районов

разных хромосом человека (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,

Х). В некоторых случаях эти повторы гомологичны двум разным

хромосомам (9 и 15, 13 и 21, 18 и Х) ( Willard,Waye, 1987).

Хромосом-специфические последовательности сателлитной альфо-

идной ДНК нашли широкое применение в молекулярной цитогене-

тике в качестве ДНК-зондов, удобных для маркирования индиви-

дуальных хромосом в метафазных и интерфазных клетках челове-

ка (Юров, 1987). Предполагается, что сателлитные ДНК играют

важную роль в поддержании структур хромосом и, возможно, в

их спаривании в процессе мейоза (Charlesworth et al., 1994).

Особое место среди сателлитных ДНК занимают микро- и

минисателлитные последовательности, представляющие собой

многочисленную группу рассеянных по всему геному относитель-

но коротких тандемных повторов. Микросателлиты - это класс

динуклеотидных повторов. Размер повторяющихся единиц в ми-

нисателитных последовательностях может меняться от 3 - 4 до

10 - 15 нуклеотидов. Отличительной особенностью микро- и ми-

нисателлитов является наличие среди них большого количества

участков, вариабильных по числу копий в кластере.

Инвертированные или обращенные повторы составляют до 5%

генома. Они состоят из двух тождественных копий длиной около

300 п.о., ориентированных в противоположных направлениях на

одной нити ДНК и лежащих на расстоянии от нуля до десятка

тысяч пар нуклеотидов друг от друга (в среднем - 1,6 кб).

Около 1/3 обращенных повторов не разделены промежуточными

последовательностями и носят название палиндромов. Среднее

расстояние между двумя различными парами инвертированных

повторов около 12 кб, и их распределение по геному носит

случайный характер. Комплементарные пары легко ассоциируют

при отжиге, образуя шпилечные структуры с дуплексной ножкой

и однонитевой петлей, длина которой соответствует расстоянию

между парой обращенных повторов. Вследствие этого оказыва-

ются приблеженными достаточно удаленные друг от друга участ-

ки ДНК, что важно для работы ряда ферментов, обеспечивающих

процессы репликации и транскрипции. Важно отметить и то, что

однонитевой участок ДНК, образующий петлю, становится

доступным для действя нуклеазы S1, специфически разрушающей

однонитевую ДНК.

Группа умеренно повторяющихся последовательностей очень

гетерогенна по длине и числу копий и составляет около 20%

генома человека. Как правило, они распределены дисперсно по

всем хромосомам, причем относительно короткие последователь-

ности ДНК до 500 п.о., так называемые короткие диспергиро-

ванные повторы - Sine, повторяются более 100 000 раз, в

среднем, через каждые 2.2 кб. Число копий более длинных

диспергированных последовательностей - Line, не превышает 10

000. Умеренные повторы найдены во всех структурных компонен-

тах генома за исключением кодирующих областей генов. Два

главных семейства умеренных повторов, Alu и Kpn1, занимают,

по крайней мере, 10% генома и практически столько же занято

несколькими сотнями других семейств повторов этого класса.

Основной единицей Alu семейства является короткая

последовательность из 300 п.о., повторенная в геноме челове-

ка несколько сот тысяч раз, в среднем, через каждые 5 кб или

через каждые 2 - 3 диспергированных повтора, принадлежащих

другим семействам (Kao, 1985; Льюин, 1987). При этом,

кластеры Alu-повторов, как правило, лежат внутри R-дисков

метафазных хромосом - Гимза отрицательных (G- дисков). Расп-

ределение Alu-повторов по геному весьма неравномерно как

между хромосомами, так и по их длине. Так, в хромосомах 14,

16, 21 Alu-последовательности концентрируются в области

центромеры, а в хромосомах 4, 19, 20, Х и У выраженные

кластеры Alu повторов не найдены. Члены Alu семейства не

полностью идентичны друг другу. Однако, все они содержат

сайт рестрикции для фермента AluI и имеют димерную структу-

ру, то есть состоят из двух прямых повторов длиной около 130

п.о. с богатой аденином вставкой из 31 нуклеотида во втором

мономере. Каждая Alu последовательность фланкирована прямыми

повторами длиной от 7 до 20 п.о., различными для разных чле-

нов семейства и имеющими большую степень гомологии с

транспозоноподобными элементами про- и эукариот. Некоторые

члены Alu семейства могут транскрибироваться с помощью фер-

мента РНК-полимеразы 111. Предпологается, что при определен-

ных условиях образующиеся при этом молекулы РНК могут обрат-

но транскрибироваться, что в свою очередь, может привести к

появлению в клетках Alu-содержащих кДНК, обладающих

свойствами ретропазонов, то есть способных инсертироваться в

геномную ДНК. В литературе описаны случаи инсерционного му-

тагенеза Alu повторов, приводящие к гемофилии В и нейрофиб-

роматозу типа 1. Однако, частота таких событий, по-видимому,

невелика. Предполагается, что короткие умеренные повторы,

подобные Alu семейству, участвуют в регуляции транскрипции,

в процессинге РНК и в инициации репликации ДНК. Кроме того,

обнаружена высокая степень гомологии Alu последовательностей

с одним из видов низкомолекулярной РНК (7 S РНК), участвую-

щей в секреции белков.

К числу Line повторов относится Kpn1 семейство, которое

состоит из более длинных и значительно более гетерогенных

последовательностей, рассеянных по всему геному. В ряде слу-

чаев члены Kpn1 семейства группирются в кластеры, образуя

более длинные структуры, повторяющиеся несколько тысяч раз.

Для некоторых членов этого семейства также доказана возмож-

ность инсерции кДНК-овых копий Kpn1- РНК-транскриптов в ге-

номную ДНК и возникновение мутаций. Такое явление было обна-

ружено в одном случае гемофилии А. Некоторые Kpn1- последо-

вательности не только транскрибируются, но и способны

транслироваться (Charlesworth et al.,1994).

Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-

ны.

Многие гены человека повторены в геноме от нескольких

единиц до нескольких сотен раз и образуют мультигенные се-

мейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,

1985; Льюин, 1987). Эти гены обычно сгруппированы в кластеры

в определенных районах одной, либо нескольких хромосом. Во

многих мультигенных семействах наряду с функционально актив-

ными генами содержатся псевдогены - мутационно измененные

последовательности, не способные транскрибироваться или про-

дуцирующие функционально неактивный генный продукт. Примера-

ми мультигенных семейств могут служить гены рибосомальных,

транспортных и ядерных РНК, гены альфа- и бета-глобинов, ту-

булинов, миоглобина, актина, интерферона и многих других. В

ряде случаев, возможна избирательная амплификация некоторых

семейств генов в процессе их экспрессии, как, например, ге-

нов рибосомальных РНК. При этом число способных транскриби-

роваться копий генов увеличивается за счет их избирательной

амплификации в сотни и даже тысячи раз, что сопровождается

лавинообразным нарастанием доли соответствующего генопродук-

та в клетках. Особое место среди мультигенных семейств зани-

мают супергены - очень большие кластеры из сотен функцио-

нально и структурно родственных генов, расположенных в сег-

ментах отдельных хромосом. Классическим примером супергена

может служить HLA комплекс, контролируюший главные антигены

гистосовместимости. Он занимает район более 6000 кб на ко-

ротком плече хромосомы 6р21 и состоит из серии тесно сцеп-

ленных генов, ответственных за синтез множества белков,

включающих клеточные поверхностные антигены, молекулы иммун-

ного ответа и некоторые компоненты комплемента. К суперген-

ным семействам относятся три комлекса расположенных на раз-

ных хромосомах мультигенов, контролирующих синтез тяжелых и

легких цепей иммуноглобулинов. Интересно, что в процессе

диффиренцировки B лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины,

происходит структурная перестройка этих семейств. При этом

отдельные последовательности ДНК элиминируются, тогда как

другие сливаются, так что структура генов иммуноглобулинов в

зрелых B лимфоцитах значительно отличается от исходной, то

есть от той, которая наблюдается в зародышевых клетках.

Одной из важных структурных особенностей генома челове-

ка является наличие так называемых псевдогенов, уникальных

последовательностей, очень сходных по своей структуре с оп-

ределенными нормальными генами, но в силу присутствия в ко-

дирующих последовательностях целого ряда мутаций не способ-

ных транскрибироваться или правильно транслироваться с обра-

зованием структурно и функционально активного продукта.

Псевдогены обнаружены для многих генов. Их количество варь-

ирует от одной до нескольких десятков копий на геном и в

этом случае они, как правило расположены тандемно. Иногда

псевдогены тесно сцеплены с нормальными генами, во многих

случаях псевдогены и гены локализованы в разных хромосомах.

Для некоторых моногенных заболеваний идентифицированы му-

тантные аллели, сходные с мутациями в соответствующих псев-

догенах. В этих случаях обсуждаеся возможная роль псевдоге-

нов в спнтанном мутационном процессе.

В геноме человека присутствуют также нуклеотидные

последовательности, гомологичные генам некоторых вирусов.

Впервые эти последовательности были идентифицированы в гено-

ме вирусов, индуцирующих развитие опухолей у животных и че-

ловека, и потому они были названы онкогенами. Гомологичные

последовательностям в геноме человека носят название прото-

онкогенов. В настоящее время уже идентифицировано более 100

протоонкогенов. Белковые продукты протоонкогенов, по-видимо-

му, играют важную роль в нормальной пролиферации клеток осо-

бенно на ранних стадиях эмбрионального развития, контролируя

клеточный цикл и выбор геномной программы развития клетки.

При возникновении специфических мутаций в протоонкогенах, а

также при нарушениях регуляции их работы, выражающихся в ги-

перпродукции или в зкспрессии в нетипичномном месте или в

несвойственный момент жизнедеятельности клетки, они начинают

вести себя как онкогены, стимулируя неконтролируемое размно-

жение и пролиферацию определенных клеточных клонов, что и

может, в конечном счете, привести к формированию опухоли.

Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",

транскрипция, регуляторные элементы генов.

Около 10-15% генома человека представлено уникальными

транскрибируемыми последовательностями, составляющими основу

структурных генов (Льюин, 1987). В настоящее время в понятие

"ген" включается не только его транскрибируемая область -

экзоны + интроны, но также фланкирующие последовательности -

лидерная, предшествующая началу гена, и хвостовая нетрансли-

руемая область, раположенная на 3' конце гена (Рис.2.1 ). В

отличие от генов прокариот гены человека редко представлены

одной непрерывной последовательностью и в подавляющем боль-

шинстве имеют прерывистую структуру. Относительно короткие

кодирующие участки - зкзоны, чередуются с длинными интрона-

ми, которые транскрибируются и входят в состав первичного

РНК-продукта, но затем при процессинге первичного РНК

-транскрипта они вырезаются и не участвуют в трансляции.

Процесс вырезания интронов из первичных транскриптов получил

название сплайсинга. Таким образом, в зрелой мРНК интронные

области отсутствуют, а экзоны составляют непрерывную кодиру-

ющую последовательность. Размеры зрелых мРНК нередко в

десятки раз меньше первичных РНК-транскрипов и, соот-

ветственно, размеров самого гена.

Согласно классическим представлениям ген - это локус,

на хромосоме, мутации в котором реализуются на уровне фено-

типа. В молекулярной биологии ген трактуется как ассоцииро-

ванный с регуляторными последовательностями фрагмент ДНК,

соответствующий определенной единице транскрипции. Следова-

тельно, представления о гене формальных генетиков далеко не

полностью тождественны его физической единице и соотношения

между этими двумя понятиями достаточно запутанные. Отметим

некоторые причины этих противоречий. Известно, что мутации

одного гена могут приводить к совершенно разным и даже в ря-

де случаев к комплементарным фенотипам. Результаты прямого

секвенирования генома свидетельствуют о присутствии в нем

значительного большего числа генов, чем можно ожидать от ре-

зультатов мутационного анализа. Одна и та же последователь-

ность ДНК в геноме может кодировать несколько различных бел-

ков, что достигается за счет так называемого альтернативного

сплайсинга (образование разных мРНК из одного первичного

РНК-транскрипта). В крупных интронах ряда генов обнаружены

смысловые последовательности других генов ("ген в гене"),

считываемые в противоположном направлении. Транскрипционные

единицы генома могут перекрываться за счет наличия разных

промоторов. Наконец, благодаря соматической рекомбинации

структура транскрибируемых последовательнстей некоторых ге-

нов может быть различной в разных клонах клеток одного орга-

низма (Т-клеточные рецепторы). Ситуация с определением поня-

тия "ген" еще больше осложняется, если в это понятие вклю-

чать многочисленные регуляторные последовательности. Возни-

кает вопрос: "Как далеко от гена могут располагаться эти

последовательности, чтобы их можно было включать в структуру

гена?". Для многих целей оказывается удобным введенное в

последнее время понятие "считаемый ген"- counting gene.

Последний рассматривается как отдельная транскрибируемая

единица ДНК или её часть, которая может транслироваться в

одну или несколько взаимосвязанных аминокислотных последова-

тельностей. Поэтому последовательность, дающая две

транскрипционные единицы за счет альтернативного сплайсинга

и, как следствие, два разных белка учитывается как один ген.

Однако, если степень гомологии двух генопродуктов, имеющих

общий транскрибируемый участок, невелика, то эти последова-

тельности расцениваются как два разных гена (Fields et

al.,1994).

По своему функциональному назначению гены могут быть

разделены на две группы. Группа I представлена генами, коди-

рующими собственно белки; группа II - генами, контролирующи-

ми синтез рибосомальных, транспортных и ядерных РНК. По ха-

рактеру экспрессии гены также могут быть подразделены на две

группы - гены "домашнего хозяйства" (housekeeping genes),

продукты которых необходимы для обеспечения жизнедеятель-

ности любого типа клеток, и тканеспецифические гены, обеспе-

чивающие специализированные функции клеток, то есть гены,

функционально активные только в определенных типах клеток

(тканей) и только на определенных стадиях онтогенеза, так

называемые гены терминальной дифференцировки.

Считается, что средние размеры гена человека составля-

ют, примерно, от 10 до 30 кб. Однако, эта величина может ко-

лебаться от нескольких десятков до миллионов пар нуклеоти-

дов. Согласно последним данным, самый маленький из известных

генов- МСС-7, имеет размеры всего 21 п.о. (Gonzales-Pastor

et al.,1994), а самый болшой - ген дистрофина -2.2 мегабаз.

Гены отделены друг от друга протяженными промежутками -

спейсерами, содержащими в своем составе большое количество

повторяющихся последовательностей ДНК и нетранскрибируемые

уникальные последовательности.

Рассмотрим более подробно современные данные о числе

генов в геноме человека. Полученные разными методами оценки

этой величены приведены в Табл.2.1. Исходя из размера генома

(около 3 000 миллионов п.о.), и среднего размера одного гена

порядка 10 - 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), общее число генов

должно быть порядка 100 000. При этом, как уже указывалось,

распределение генов на хромосомах крайне неравномерно. Уста-

новлено, что более 90% генов находится в Гимза -отрицатель-

ных районах метафазных хромосом, в так называемых R-бэндах

(Antequera,Bird ,1993). Проведенные недавно прямые исследо-

вания методом секвенирования показывают, что в R-бэндах их

число достигает 43-50 на один бэнд, а в Гимза- положительных

районах хромосом (G бэндах), - только 1-2 на 75-80 килобаз,

то есть всего в геноме можно ожидать около 70 000 генов.

Оценка числа генов по доле транскрибируемой части генома

(всего 12%) дает совсем маленькую величину - 20 000 генов

(Wagner et al.,1993). Методом исследования кинетики реассо-

циации РНК в культуре клеток число генов оценивается между

20 - 40 000 (Lewin, 1990). В то же время в клетках мозга

число различных мРНК по некоторым данным достигает 97 000

(Wagner et al.,1993). Наиболее точные подсчеты числа генов

человека проведены в последнее время и основаны на оценке

числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной

области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 %

генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специали-

зированные функции дифференцированных клеток, находятся об-

ласти коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны мо-

лекулярные методы точной регистрации этих участков, которые

показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число

структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,

1993). Практически такое же число генов (64 000) определено

недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последова-

тельностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).

Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод,

что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000

отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть

генов.

Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона,

где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной

гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюда-

ется, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окружен-

ного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами

и интронами имеются консервативные канонические последова-

тельности, играющие существенную роль в обеспечении точности

вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные

последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчива-

ются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорны-

ми и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих

структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная после-

довательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации

первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный

сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с

одного и того же первичного РНК транскрипта.

Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента

РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспе-

чивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и от-

ветственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимера-

за II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно

структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в

ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.

РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт-

ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва-

ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает

доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами

(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру-

ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает

продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая

двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот

процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала,

представляющего собой один или несколько терминирующих кодо-

нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15


© 2007
Использовании материалов
запрещено.