 |
РУБРИКИ |
Литература - Другое (книга по генетике) |
РЕКЛАМА |
||
|
Литература - Другое (книга по генетике)тов кДНК экспрессирующихся генов-EST см.Главу III.), а также 4более 05 000 полноразмерных структурных генов. Благодаря мно- гочисленным полиморфным сайтам и, главным образом, микроса- теллитным молекулярным маркерам, созданы подробные (1,5-2 сантиморганные) генетические карты для каждой хромосомы че- ловека. Это позволило перейти от функционального к позицион- ному картированию, т 4о 0е 4сть 0картированию новых генов не- посредственно на физической карте ДНК целого генома. По мнению авторитетных специалистов по генетическому картированию таких как Питер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах и др 4угих, 0дальнейшее наращивание плотности молекулярных марке- ров на хромосомах человека уже лишено смысла, тем более, что в процессе идетификации все новых и новых генов методом EST, новые полиморфные сайты все равно будут найдены. Не менее оптимистично обстоят дела и с секвенированием, т 4о 0е 4сть 0вы- яснением первичной нуклеотидной последовательности всей двухметровой молекулы ДНК человека. Достаточно заметить, что первоначальная стоимость секвенирования одной пары нуклеоти- дов оценивалась в 1 $, сейчас она составляет уже около 40 центов и продолжает снижается. Причина этого - широкая авто- матизации монотонного процесса секвенирования. Так, 10 робо- тов фирмы Applied Biosystems за одну неделю секвенируют бо- лее 30 000 000 п 4ар 0о 4снований. 0Дальнейшее совершенствование технологии секвенирования 4, 0создани 4е 0принципиально новых под- ходов (метод "чипов"-Мирзабеков А.Д., Ed.Southern ), 4повышающих в десятки раз 0степен 4ь 0автоматизации этого про- цесса в высокоспециализированных центрах позволяет наде- яться, что секвенирование всего генома человека будет завер- шено в 2 006 году, а вполне вероятно и к 2 000 году! Однако, само по себе завершение гигантского по замыслу и грандиозного по реализации научного проекта "Геном человека" отнюдь не означает, что процесс познания генома завершен. Уже сейчас становится очевидным, что не существует какого-то усредненного генома человека, каждый геном как и каждый че- ловек сугубо индивидуален. Эта индивидуальность генома про- является не только на уровне отдельной личности, но и на уровне этнических групп, наций, отдельных популяций и рас (Cavalli-Sforsa,1994). Геном человека как система динамич- ная, очень разнообразен. Анализ этого разнообразия (diversity) - одно из важнейших продолжений программы Геном человека. Еще более актуальным является выяснение "функцио- нальной карты генома". Секвенирование позволит расшифровать порядок всех 3 4.5 0х 10 4! 09 нуклеотидов. Но ведь это только на- чало. Определить границы генов, выяснить положение много- численных регуляторных элементов, их интронно-экзонную структуру и, наконец, функциональное назначение каждого из 60 000 генов, назначение которых пока неизвестно - вот сле- дующая поистине глобальная задача молекулярной генетики. Вполне вероятно, что именно на этом пути удастся решить за- гадку "избыточной ДНК", понять эволюцию (филогенез) генома человека и ,возможно, расшифровать партитуру симфонии жизни - т 4о 0е 4сть 0последовательность включения и выключения генов в ходе онтогенеза. На генетические карты человека уже в 1994г. нанесено 933 гена, мутации которых приводят к различным наследствен- ным заболеваниям, причем более 400 из них проклонированы, т 4о 0е 4сть 0выделены в чистом виде и размножены вне оргаизма че- ловека в составе ДНК фагов, вирусов, дрожжей и бактерий. Для многих из этих генов, в особенности, сопряженных с наиболее частыми, социально значимыми заболеваниями, подробно изучены спектры мутаций, охарактеризованы аллельные полиморфизмы и разработаны схемы молекулярной диагностики. Причем, если в 1993г. таких заболеваний было около 130 (Bob Williamson), то в 1994 - более 600. По-сути, уже сегодня каждый наследствен- ный недуг, ген которого картирован, доступен молекуярной ди- агностике прямыми или косвенными методами. Помимо моногенных болезней, проблемы молекулярной диаг- ностики которых в значительной степени уже решены, все боль- ше внимания сегодня уделяют мультифакториальным заболевани- ям. На повестке дня молекулярная диагностика предрасположен- ности к таким широкораспространенным недугам как атероскле- роз, ишемия сердца, онкологические 4, психиатрические 0заболе- вания, диабет и мн 4огое 0друг 4о 0е. Выяснение генетической приро- ды этих болезней, равно как досимптоматическая диагностика многих моногенных болезней с поздней манифестацией, ставит перед исследователями 4, 0т 4о 0е 4сть 0молекулярными биологами и врачами 4, 0проблему целесообразности такой досимптоматической диагностики, права личности на исключительность знаний о собственном геноме, точнее о тех мутациях и генетических предрасположенностях которые закодированы в нем еще до рож- дения. Для некоторых заболеваний 4( 0муковисцидоз, фенилкетону- рия) такая ранняя диагностика, безусловно, целесообразна, так как позволяет начать лечение до начала заболевания. Для тех же нозологий, где реальной терапии пока нет (хорея Ген- тингтона, другие болезни "экспансии", миодистрофия Дюшенна и др.) целесообразность такой диагностики и, главное, конфи- денциальность полученной информации широко обсуждаются. Да, уже сейчас вполне реально говорить о "генетическом паспорте новорожденных", т 4о 0е 4сть 0о том, что уже вскоре после рождения с помощью автоматизированной системы удасться проа- нализировать весь спектр наиболее частых мутаций широко распространенных заболеваний как моногенной так и мультифак- ториальной природы 4, в 0том числе и генов, мутации которых с высокой вероятностью могут привести к раку молочной железы, толстого кошечника, к атеросклерозу, диабету и мн 4огим 0другим ттяжелым недугам. Жить 4, 0н 4и 0в чем себя не ограничивая, засу- нув как страус голову в песок, либо, зная, что у вас мутация в гене глутатионтранферазы, а следовательно, высока вероят- ность болезней легких (особенно рака) воздержаться от куре- ния ? Что лучше, добровольные ограничения и периодические осмотры или состояние счастливого неведения, грозящее неми- нуемой катастрофой ? А сколько мультифиакториальных заболе- ваний можно избежать, зная о слабых и сильных сторонах свое- го генома! В настоящее время в США провдятся массовые опросы населения, цель которых выяснить целесообразность досимпто- матической диагностики в семьях высокого риска, доступность (конфиденциальность) этой информации для членов семьи, нани- мателей, страховых компаний и пр. Иными словами, практически овладев плодом Древа Познания - собственным геномом- челове- чество поставлено перед дилеммой как сделать так, чтобы польза от него оказалась много весомее, чем потенциальный вред. Неслучайно, сегодня уже на новом, молекулярном уровне всплывают идеи "улучшения человеческой породы " Фрэнсиса Гальтона, правда, неимеющие ничего общего с примитивной ев- геникой прошлого. Обрели реальность и казавшиеся невозможны- ми в недалеком прошлом идеи патентования отдельных генов и их фрагментов, потенциально особенно перспективных для моле- кулярной диагностики и биотехнологий. Несмотря на протесты руководителей программы "Геном человека" Фрэнсиса Коллинса, Томаса Каски и широкой научной общественности патент- носпособность генома человека, по крайней мере, его отдель- ных фрагментов, генов (например, гена BRCA-1- мутации кото- рого резко увеличивают вероятность рака молочной железы) по- лучила одобрени 4е 0 законодательных комитетов США Еще больше этических и моральных вопросов порождает ге- нотерапия. Однако, и в этой области наметилась определенная эволюция взглядов как специалистов, так и широкой обществен- ности. От полной неприемлемости такого подхода в 70-80-х го- да 4х 0уходящего века до признания безопасности (при соблюдении необходимых правил) генноинженерных манипуляций на сомати- ческих клетках. Между тем, логика подсказывает, что по мере того как все больше соматических мутаций удастся исправить с помощью генной терапиии, тем значительней будет их вклад на уровне половых клеток. Тем больше будет шанс того, что 4при 4вступлении 0в брак гомозигот по аутосомно-рецессивным заболе- ваниям 4(а вероятность такого события будет возрастать по 4мере совершенствования методов лечения генетических 4болезней) 0, все дети 4будут здоровы, хотя и получат от своих 4родителей мутантные гены. Это станет особенно реальным в 4связи с успешной разработкой методологии доимплантационной 4диагностики наследственных болезней. Поэтому 0в научной лите- ратуре все настойчивее звучит тема генокоррекции на уровне половых клеток или ранних зародышей человека. Современный методоческий уровень пока еще не позволяет с абсолютной уве- ренностью осуществлять направленный перенос гена в половые клетки и клетки дробящихся зародышей. Пока этого удалось достичь только в экспериментах с эмбриональными стволовыми клетками, причем на 1-м этапе возникший организм, в действи- тельности, является мозаиком по введенному гену (см. Главу V 4I 0II). Естественно, это не означает, что проблема гомолого- гичной рекомбинации нормального и мутантного гена на уровне половых клеток и ранних зародышей принципиально неразрешима. Однако, потребуется еще много времени, возможно не одно десятилетие XXI-го века, прежде, чем эта задача будет успеш- но решена. В настоящее время мнение специалистов и широкой общественности - максимально предотвратить возможность попа- дания чужеродного генетического материала в половые клетки, с тем, чтобы избежать непредсказуемых, а, скорее всего, весьма печальных, последствий для человечества такого трансгеноза. Нет, однако,сомнений в том, что, если конец ХХ-го века ознаменован расшифровкой молекулярной структуры генома чело- века, то век XXI прославится выяснением его функций на уров- не отдельных генов, генных сообществ, хромосом , также всего генома вцелом в контролировании процессов онто- и филогене- за. Молодым людям, вступающим в ХХI век, необходимо знать, 4на каком этапе 0находится наука 4о структуре и функциях 0геном 4а человека. Это важно не только с сугубо утилитарных, меди- цинских позиций (хотя и этот аспект крайне важен), но и с позиций общечеловеческих. Ибо всякое эпохальное открытие на- уки (а именно таковым и является расшифровка генома челове- ка) до недавнего времени использовалось не только во благо, но и во вред человечеству ( 4п 0ечальный пример тому - открытие расщепления ядра урана, породившее атомную бомбу). Неразум- ные эксперименты с геномом человека могут привести к еще бо- лее страшным последствиям. Уберечь генофонд человечества, всячески оберегая его от рискованных вмешательств, и при этом извлечь максимальную выгоду из уже полученной бесценной информации в плане диагностики, профилактики и лечения мно- гих тысяч наследственно обусловленных недугов - вот задача, которую необходимо решать уже сегодня 4и 0с которой мы прийдем в новый XXI век ! ГЛАВА IX. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ. Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм- мы генной терапии. В широком смысле слова генная терапия означает лечение путем введения в ткани или в клетки пациента смысловых пос- ледовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассмат- ривалась как возможность исправления дефекта в гене. Счита- лось, что основным обьектом для такого лечения будут служить моногенные наследственные заболевания человека, причем тео- ретически представлялась вероятной коррекция генного дефекта как на соматическом уровне, так и на уровне зародышевых (по- ловых) клеток. Многочисленные эксперименты по созданию трансгенных животных, начатые после 1980 г., а также на культурах клеток внесли существенные коррективы в эти теоре- тические представления. Во-первых, оказалось значительно проще исправлять не сам дефект в гене, то есть заменять весь мутантный ген или его мутированный фрагмент на нормальный, а вести коррекцию путем введения в организм пациента полноцен- но работающего гена (обычно его кДНК). Во-вторых, несмотря на решающие успехи генной инженерии последних лет, исследо- вания по геннной терапии у человека осуществляются исключи- тельно на соматических тканях, в которых в норме происходит экспрессия дефектного гена. Генная терапия на уровне половых и зародышевых клеток человека ввиду возможных серьезных пос- ледствий для генофонда человечества представляются весьма проблематичной и на данном этапе наших знаний - малореаль- ной. И наконец, в-третьих, уже разработанная и применяемая на практике методология генной терапии оказалась пригодной для лечения не только моногенных наследственных заболеваний, но и таких широко распространенных болезней, какими являются злокачественные опухоли, многие виды тяжелых вирусных инфек- ций, включая спид, сердечно-сосудистые и другие заболевания. Учитывая эти обстоятельства, генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, онкологи- ческих, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболева- ний путем введения генов в клетки пациентов с целью направ- ленного изменения генных дефектов, либо придания клеткам но- вых функций (Culver, 1994). Первые клинические испытания ме- тодов генной терапии были предприняты 22 мая 1989г. с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Маркированные прокариоти- ческим геном neo, Т-лимфоциты были устойчивы к неомицину и могли быть легко отселектированы в культуре, что позволило детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное накопление в опухолях (подробней см. 9.5). Первым моногенным наследственным заболеванием, в отно- шении которого были применены методы генной терапии, оказал- ся наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозин-дезаминазы. 14 сентября 1990г.в Бетезде (США) 4-х летней девочке, страдающей этим достаточно редким забо- леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лим- фоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процеду- ра была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Anderson, 1992; Culver, 1994). В течение 3-х лет терапии в общей сложности проведено 23 внутривенных трансфузии ADA-трансформированных Т-лифоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В резуль- тате лечения состояние пациентки (Ашанти В. ДеСильва) нас- только улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием (подробней см. раздел 9.5). В настоящее время клинические испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Ита- лии, Франции, Великобритании и Японии. Другие моногенные наследственные заболевания, в отноше- нии которых уже имеются официально разрешенные протоколы и начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолес- теринемии (1992); муковисцидоза (1993); гемофилии В (1992); болезни Гоше (1993). В отношении многих других заболеваний медицинские протоколы клинических испытаний находятся в ста- дии утверждения (см. раздел 9.5.). К 1993г. только в США к клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций на чело- веке было допущено 53 проекта (Culver, 1994). К 1995г. в ми- ре число таких проектов возросло до 100 и более 400 пациен- тов было непосредственно вовлечено в эти исследования (Hodg- son, 1995). Подавляющее большинство таких проектов (86) ка- салось лечения онкологических заболеваний, а также спида. Таким образом, от опытов на животных и теоретических построений 80-х годов уже в 1990 году удалось приступить к реальному лечению моногенных заболеваний, число которых стремительно нарастает. Естественно, что подобные революци- онные перемены могли возникнуть только в результате решающих успехов молекулярной биологии в картировании генов, мутации которых приводят к наследственным заболеваниям (см.Главу III), выяснении молекулярной природы этих мутаций (см.Главу IV), успехов в секвенировании и клонировании генов (см.Главы I и II), создании генно-инженерных конструкций (см.Главу II), отработки и совершенствования методов их доставки (см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска- чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри- ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря тому, что предшествующие экспериментальные и клинические исследования доказали безопасность генной терапии. Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова- ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста- точно. Следует помнить, что введение в организм человека последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс- твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож- даться функциональным дисбалансом. Современные представления о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и вирусными последовательностями, часто используемыми в ка- честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать- ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель- ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства. Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль- ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом (Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе- ния дополнительной полезной информации превосходили потенци- альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области, особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс- ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс- пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож- ны только после ее одобрения соответствующим законодательно утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив- ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам (Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза- тельным утверждением проекта директором Национального Инсти- тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992; Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос- тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев- ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии (European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy) (Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли- нических испытаний должны включать следующие разделы: обос- нование выбора нозологии для проведения курса генной тера- пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди- фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс- генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co- hen-Haguenauer, 1995). Важнейшим элементом в программе генной терапии является анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово- дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу- ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях. Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по- мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии введенных генов путем идентификации и количественной оценки соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по- лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме- дицинского обследования и вносят необходимые исправления и добавления в проводимую схему лечения. Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы- бор клеток-мишеней. Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе построения программ генной терапии. Итак, генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише- ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па- тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст- ранению патологических процессов. В первом случае, в орга- низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева- ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству- ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ- фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель- но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге- нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера- певтические свойства после трансфекции. В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те- рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи- вирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин- фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время большинство допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии использует именно этот подход (Cul- ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в крупных специализированных центрах, требует больших матери- альных затрат и высоких биотехнологий. Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло- нированных и определенным образом упакованных последователь- ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь- ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен- но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс- таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе- мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта- ми генетической модификации являются специфические типы ле- гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут использоваться для модификации различных типов клеток и со временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и универсальным способом доставки чужеродного генетического материала в любые ткани. Эффективность курса генной терапии в значительной сте- пени зависит от правильного выбора типов соматических кле- ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика- ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге- нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю- бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан- ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует- ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи- ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер- вичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового про- дукта, а также биохимический анализ патологического процес- са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую- щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти- ческих вмешательств определяется также доступностью кле- ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга- низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле- ток, длительностью экспрессии введенного гена. Наиболее перспективной представляется возможность гене- тической модификации не самих уже дифференцированных клеток с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые при создании определенных микроусловий могут дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи предложенный недавно эффективный метод получения стволовых клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995). Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене- тической модификации, завершается оценкой результатов пере- носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба- цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про- водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари- тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет- ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его коррекции на биохимическом уровне. Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия- ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи- модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор- ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi- vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли- чество синтезированного белка, необходимое для нормализации биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от- вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно быть модифицировано для восстановления нарушенной функции. Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про- верка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Показатели длительности и характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров для оценки необходимой периодичности повторения терапевти- ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже- родного гена и опасность вирусной контаминации в результате использования компетентного по репликации вектора (см.ниже), могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соот- ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи- вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли- нических испытаний. Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те- рапии. Решающим условием успешной генотерапии является обеспе- чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто- ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель- ной персистенции его в этих клетках и создание условий для полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК, лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси- рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями, белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE - декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота), либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли- шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис- тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва- ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи- мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес- пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос- новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя- ются на химические, физические и биологические. Эффектив- ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро- ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1. Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек- ции in vitro (Culver, 1994). --------------------T------------T-------------T------------¬ ¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦ +-------------------+------------+-------------+------------+ ¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦ +-------------------+------------+-------------+------------+ ¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦ ¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦ ¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦ +-------------------+------------+-------------+------------+ ¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦ ¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦ ¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦ ¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦ +-------------------+------------+-------------+------------+ ¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦ ¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦ ¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦ ¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦ ¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦ ¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦ ¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦ ¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦ ¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦ L-------------------+------------+-------------+------------- Как следует из представленных данных, введение чужерод- ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по- мощи некоторых физических способов доставки (электропоации, бомбардировки частицами золота), так и, практически, при всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет- ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства- ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра- вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге- на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности способны к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс- прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи, что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола- гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны на применении ретровирусных векторов. Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий, Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от- сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%) трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо- кой пакующей способностью (включение генетической конструк- ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не- интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он- когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек- тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995). Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер- шенствование методов трансформации клеток человека. 9.4.1. Основные векторные системы. В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем. Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи- муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина- лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес- кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую последовательность определенного гена, инсертированную в экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со- держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе- та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду- цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь- ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген (neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про- изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре- дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз- мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по- лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак- териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки. Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус- ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны. 9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот. Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК. Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу- жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо- жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает- ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1 года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб- риллах (Hansen et al.,1991). Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции (метод применяемый сегодня почти исключительно для создания трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук- леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи электропорации (кратковременного воздействия сильным элект- рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод- ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди- ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод бомбардировки, который при наличии специального генно- го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et al., 1990). Для повышения эффективности переноса обычно используют системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо- действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег- чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс- твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой доставки является система кальций-фосфатной копреципитации, широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс- трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка- честве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован- ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую- щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген- ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри- мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.). Важным компонентом системы является аденовирус или его N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу- зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн- досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес- ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс- трукций, их несомненную перспективность для генной терапии in vivo (Hodgson, 1995). Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и физико-химического подхода при конструировании систем для переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно- вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа- га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер- тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили- зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз- мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес- печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю- щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после- довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель- ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер- нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно функционирует. Направленный перенос генов во многие типы клеток, со- держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде- альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре- цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг- менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб- ная система разработана для рецептор-опосредованного генного переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова- нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли- мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет- ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо- цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли- зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под- ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы клеток. 9.4.3 Липосомный метод трансфекции. Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег- радации лизосомальными ферментами достигаются при использо- вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла- дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли- пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица- тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен- но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф- фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь- ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта- мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом получена в экспериментах на культурах клеток при использова- нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим пептидом грамицидином S. Особенно перспективными в последнее время представляют- ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы) либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе- чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет- ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе- реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До- казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге- на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи- вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе- ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен- ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро- вень холестерина в крови животных устойчиво понижался. Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным векторным системам. Вместе с тем, до сих пор не решена проб- лема низкой частоты трансформации клеток при липосомном пе- реносе. Это обстоятельство существенно ограничивает примене- ние липосом в генной терапии (Crystal, 1995). Тем ни менее, в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи генетической информации в клетки эукариот с использованием в качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков, а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в одной системе совместить преимущества физико-химических ме- тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап- равлений в трансфекции эукариотических клеток. 9.4.4 Рекомбинантные вирусы. Конструирование векторов на базе вирусов представляет собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера- пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно- го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматри- вать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для кле- ток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции кле- ток человека in vitro и in vivo, который необходим для про- явления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные эксперименты на животных и первые клинические испытания ут- вержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем, нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологи- ческих процессов, связанных с использованием вирусных час- тиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные виру- сы, вирус герпеса, вирус спида (HIV), вирус ветряной оспы и некоторые другие (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein, 1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). Учитывая большую прак- тическую значимость этих векторов, рассмотрим их более под- робно. _Ретровирусные векторы. . Генные конструкции на основе ретровирусов (РНК-содержащих вирусов) особенно часто исполь- зуются для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярный рет- ровирусный вектор - вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV). По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные ге- ны и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматичес- ких клеток. Для безопасности ретровирусные последовательнос- ти модифицируют таким образом, что в инфецированных ими клетках вирусные белки не производятся. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих последователь- ностей вируса. Репликация вирусных векторов может происхо- дить только в специальных "пакующих" клетках, в геном кото- рых встроены все гены, производящие вирусные белки. При вве- дении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирио- ны, несущие векторную РНК и способные лишь проникать в клет- ки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой систе- мы, также как и других векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации производящей клеточной ли- нии нормальным ретровирусом и получения на этой основе ком- петентного по репликации вектора. Для предотвращения этого необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток. Возможна также контаминация ретровирусного вектора клеточны- ми РНК, некоторые из них могут обратно транскрибироваться и встраиваться в геном трансдуцированных клеток. Последстия такого события могут быть выявлены в экспериментах на живот- ных моделях. Другими серьезными недостатками ретровирусных векторов является: (1) их способность переносить генетичес- кий материал только в пролифирирующие клетки; (2) способ- ность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном; (3) возможность спонтанной активации онкогена; (4) небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8 тысяч п.о.; (5) срав- нительно низкий титр -10!6-10!7/мл рекомбинантных вирусных частиц, получаемых для трансдукции; (6) необходимость конс- труирования соответствующих "пакующих" клонов клеток. _Аденовирусные векторы. . В отличие от ретровирусов адено- вирусы активно инфецируют неделящиеся клетки, обладают боль- шей потенциальной пакующей способностью (ДНК-вставка> 8 кб), имеют высокий титр - 10!11/ мл, однако, не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном трансформированной клетки (Hodgson, 1955). Использование их перспективно для генокор- рекции клеток верхних дыхательных путей, легких и других ор- ганов - мозга, печени, мышц, кожи и пр. Они эффективны при доставке аэрозольным способом, что было использовано в пер- вых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза (Crystal et al., 1994). В аденовирусные векторы также инсер- тируют маркерные гены - neo, CAT или бета-галактозидазный ген (бета-Gal) для того, чтобы идентифицировать трансдуциро- ванные клетки. Для конструирования векторов используют де- фектные по репликации аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов, кодируюших белки (E1a, E1b)- так называемые аденовирусные векторы 2-го поколения. В настоящее время создаются аденовирусные векторы 3-го поколе- ния, в которых помимо генов Е1а и Е1b удаляют и регуляторный ген Е4. Такая конструкция может поддерживаться только в при- сутствии клеток-хелперов (например, в культуре клеток почек человека). Удаление большего числа аденовирусных генов из векторов часто сопровождается их дестабилизацией. Это один из главных недостатков аденовирусных векторов, так как в ря- де случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мише- ни, способствуют формированию иммунного ответа. Именно выра- женный иммунный ответ при повторных введениях аденовирусного вектора с инсерцией гена CFTR, оказался наиболее серьезным препятствием для успешной генотерапии муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Некоторые аденовирусные белки способны оказы- вать цитотоксический эффект на высокоспециализированные клетки человека. Схема поддержания аденовирусных векторов сходна с той, которая используется для производства ретрови- русных векторов. Велика опасность их контаминации хелперным реплицирующимся вирусом. Кроме того, аденовирусы редко ин- тегрируются в геномную ДНК и потому экспрессия переносимых ими генов, как правило, носит временный характер (Табл. 9.1). Способность инфецировать, практически, любые клетки как in vivo, так и in vitro делает особенно актуаль- ной адресную доставку таких конструкций и введение в их сос- тав тканеспецифических промотров. Например, промотор гена альфа-фетопротеина при необходимости экспрессии гена в клет- ках печени, либо промоторы генов сурфактантных белков В и С для экспрессии чужеродных генов в клетках легких. _Аденоассоциированные вирусы . обладают значительно мень- шей пакующей способностью (около 5 кб). Однако, в отличие от ранее рассмотренных вирусов не обладают онкогенной актив- ностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где пребывают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV является их способность к стабильной неслучайной интеграции в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции ви- руса определяется наличием в его геноме гена rep. Близко родственные AAV, так называемые, парвовирусы (H1, MVM, Lu- III), обладают еще меньшей пакующей способностью - около 2 кб и не имеют специфичного встраивания, однако, они также рассматриваются как потенциально перспективные векторы. _Вирус простого герпеса (HSV). . Крупный (152 кб) ДНК-со- держащий вирус, при трансформации не интегируется в геном, формируя в ядрах эписомные структуры. Уникальная особенность HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной сис- темы. Отсюда его перспективность как векторной системы для лечения опухолей мозга, болезни Паркинсона и многих других. Его известное преимущество - достаточно большая пакующая способность (>30кб). Важным этапом в создании вектора на ос- нове HSV является удаление из его генома области ICP22, от- ветственной за синтез литических белков, и индукция мутации 1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее время на основе HSV стали получать искусственные производные вируса, так назывемые ампликон-продукты, лишенные, практи- чески, всех генов HSV, но способные к репликации . Конструкции векторов, используемых для переноса экзо- генных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов, сконструированных на основе псевдо-аденовирусов, сочетает в себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом собственные вирусные гены, практически, не оказывают никако- го повреждающего эффекта на трансфецированные клетки-мише- ни, так как содержат очень мало регуляторных элементов и последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию аденовируса. Кроме того, псевдо-аденовирусные векторы с ус- пехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в де- лящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспек- тивы использования для генной терапии других вирусных сис- тем, таких как SV40, вирус иммунодефицита (HIV), вирус вет- ряной оспы и многие другие. В частности, заслуживают внима- ния эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векто- ры, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейн-Бар- ра, способного нести вставку размером от 60 до 330 кб (Sun et al., 1994). 9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем. Обзор существующих данных позволяет придти к заключе- нию, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные сис- темы далеки от совершенства (Hodgson, 1995). Если проблема доставки чуужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно реша- ется (главным образом, путем создания комбинированных рецеп- тор-опосредованных конструкций), то другие характеристики существующих векторной системы - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность - все еще нуждаются в серьёзных доработках. Прежде всего, это касается стабильнос- ти экспрессии. Последняя может быть достигнута либо при ин- теграции чужеродной ДНК непосредственно в геном реципиента, либо путем обеспечения длительной персистенции экзогенной ДНК в ядре. До настоящего времени интеграция в геном дости- галась только при использовании ретровирусных либо адено-ас- социированных векторов (Табл. 9.1). Случайная интеграция трансфектной ДНК в геном происходит достаточно редко, причем в случае ретровирусных векторов это происходит только в де- лящихся клетках. Повысить эффективность стабильной интегра- ции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем (Рис. 9.2). Однако, эти век- торные конструкции должны включать только часть вирусных ге- нов, например, гены обратной транскриптазы, ретровирусной интегразы, некоторые транспазоновые гены, парвовирусные rep-гены (см. 9.4.4). Учитывая возможный мутагенный эффект случайной интеграции, весьма перспективным представляется создание достаточно стабильных эписомных векторов. В част- ности, в последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mam- malian Artificial Chromosomes), которые могли бы достататоч- но автономно находиться в ядре, сохраняя способность к реп- ликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представ- ляются автономно реплицирующиеся циркулярные микрохромосомы раковых клеток (Hodgson, 1995). Особенно привлекательной в плане генной коррекции представляется возможность замены всего мутантного гена или его мутировавшей части (например, одного экзона) на нормаль- ный аналог, что может быть достигнуто путем гомологичной ре- комбинации. При этом в идеале можно ожидать не только дли- тельную персистенцию введенного гена, но и сохранение нор- мальной экспрессии. С этой целью в конструкции, используемые для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомо- логичного спаривания, например, бактериальную рекомбина- зу. Показано, что в этих условиях частота гомологичной ре- комбинации может превышать 2.5*10-4. Это достаточно для то- го, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток. Для направленного введения фрагментов гена в строго определенные локусы генома недавно разработана система двойной замены, основанная на использовании HPRT-зависимых эмбриональных стволовых клеток и векторной конструкции содержащей ген HPRT (гипоксантин-фосфорибзилтрансферазы) и ген тимидин-киназы вируса герпеса (HSV). Двойная селекция трансформантов позво- ляет отобрать клетки, в которых произошла гомологичная ре- комбинация. Такой подход нашел широкое применение при созда- нии искусственных моделей наследственных болезней у человека (см. подробней Главу VIII). Однако, в клинической практике он еще не используется. Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо- леваний. Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander- son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein, 1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys- tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли- кованной монографии (Culver, 1994). Уже через год после первого введения маркерного гена в организм человека была проведена успешная клеточная сомати- ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен- ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон- центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс- твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз- вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под- держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич- ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн- зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре- менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд- никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен- ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо- цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо- ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo; отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут- ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту. Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет- няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу- зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир- кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор- мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак- теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более, чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор- ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут- ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых клинических испытаний была начата программа генной терапии ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де- вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали- зация соответствующих биохимических и иммунологических пока- зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический эффект (Anderson,1992; Culver, 1994). Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста- навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем, что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те- рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро- ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови. Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство- ловых клеток показана в экспериментах на приматах. Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму- лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов применительно к другим наследственным заболеваниям. В Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи- ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу- ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания, для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и которые находятся на разных стадиях клинических испытаний. Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото- рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери- ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ). (Сulver, 1994; Lowenstein, 1994) ---T----------------T-----------------------T----------------T---- ¬ ¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия ¦ +--+----------------+-----------------------+----------------+---- + ¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ ¦ ¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ ¦ ¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦ ¦ ¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ ¦ ¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦ ¦ ¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ ¦ ¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР ¦ ¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦ ¦ ¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ ¦ ¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦ ¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ |
|
© 2007 |
|